背景技術(shù)：

1、生物產(chǎn)生的治療劑的純度受到當(dāng)局的嚴(yán)格審查和監(jiān)管，以確保安全性和有效性。因此，仍然需要高效純化生物產(chǎn)生的治療劑至高純度和足夠量的手段。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、為了支持治療性蛋白質(zhì)的臨床工作，需要從重組來源高效純化蛋白質(zhì)的組合物和方法。親和純化是一種在幾個(gè)步驟或單個(gè)步驟中分離和/或獲得所需蛋白質(zhì)純度的手段。然而，親和劑(例如，包含親和配體的親和劑)的開發(fā)可能是一項(xiàng)資源密集且耗時(shí)的任務(wù)。這導(dǎo)致僅針對(duì)有限數(shù)量的蛋白質(zhì)開發(fā)了親和劑。在不存在親和劑的情況下，純化通常涉及低效、勞動(dòng)密集且昂貴的過程(例如，多柱過程)。

2、示例性的治療性蛋白質(zhì)包括但不限于生物活性多肽/蛋白質(zhì)、融合蛋白、酶、激素、抗體、抗體片段和重組疫苗。某些蛋白質(zhì)(諸如融合蛋白)由于產(chǎn)物不均勻性或產(chǎn)物相關(guān)雜質(zhì)的存在而給純化帶來了額外的挑戰(zhàn)。一些雜質(zhì)可能由不正確組裝的融合蛋白和/或蛋白水解切割產(chǎn)生，這可能尤其難以去除，因?yàn)樗鼈兣c所需產(chǎn)物密切相關(guān)。

3、本文描述了結(jié)合蛋白質(zhì)并且可用于分離和/或親和純化的親和劑。在一些實(shí)施方案中，親和劑包含配體和固體支持物。

4、covid-19大流行凸顯了利用平臺(tái)生產(chǎn)過程快速開發(fā)治療劑和疫苗的益處。例如，在前所未有的時(shí)間內(nèi)開發(fā)出了單克隆抗體療法并獲得了緊急授權(quán)，因?yàn)樗鼈兡軌蚶闷脚_(tái)生產(chǎn)過程，主要是蛋白a親和純化平臺(tái)。在mrna疫苗的情況下，通過使用業(yè)已存在的親和純化技術(shù)(例如，oligo-dt和纖維素色譜法)來純化mrna部分也幫助加快了開發(fā)速度。因此，顯然，未來大流行病的防范以及促進(jìn)當(dāng)前全球計(jì)劃的疫苗生產(chǎn)將受益于提供平臺(tái)過程的親和純化工具的擴(kuò)展，即適用于多種疫苗。本文描述了結(jié)合三聚化結(jié)構(gòu)域并且可用于分離和/或親和純化的親和劑。在一些實(shí)施方案中，親和劑包含配體和固體支持物。

5、一些亞單位疫苗基于的是形成三聚體結(jié)構(gòu)的病毒蛋白。為了促進(jìn)正確折疊的三聚體形式的高效產(chǎn)生，可以將三聚化結(jié)構(gòu)域融合到病毒蛋白。最常用的三聚化結(jié)構(gòu)域?yàn)閠4噬菌體纖維蛋白三聚化結(jié)構(gòu)域(foldon)[tao?y,strelkov?sv,mesyanzhinov?vv,rossmannmg,1997.structure?of?bacteriophage?t4?fibritin:a?segmented?coiled?coil?andthe?role?of?the?c-terminal?domain.structure?5,789-798]和酵母gcn4三聚化結(jié)構(gòu)域[harbury?pb,zhang?t,kim?ps,alber?t,a?switch?between?two-,three-,and?four-stranded?coiled?coils?in?gcn4?leucine?zipper?mutants.science,1993,262,1401-1407]。最近以來，已開發(fā)出另一種三聚化結(jié)構(gòu)域(稱為“分子鉗”)并已證實(shí)其賦予基于包膜病毒融合蛋白的疫苗構(gòu)建體構(gòu)象穩(wěn)定性(參見例如wo?2018/176103，其全文以引用方式并入本文)。不同的病毒蛋白或病毒蛋白變體可與相同的三聚化結(jié)構(gòu)域融合以制備不同的疫苗。此外，所述三聚化結(jié)構(gòu)域還可例如用于實(shí)現(xiàn)其他(即，非疫苗)多肽/蛋白質(zhì)(特別是治療性蛋白質(zhì))的三聚化，但無意于限于wo?2018/176103的段落[0395]-[0400]中提及的任何那些。結(jié)合該三聚化結(jié)構(gòu)域的親和劑使得能夠獨(dú)立于抗原部分輕松地純化相關(guān)的亞單位疫苗并因此為疫苗生產(chǎn)和/或純化提供了平臺(tái)技術(shù)。

6、在一些實(shí)施方案中，親和劑(或所述親和劑中包含的配體)包含3螺旋束蛋白(或者稱為“三螺旋束蛋白”)，優(yōu)選反向平行3螺旋束蛋白。在一些實(shí)施方案中，3螺旋束蛋白的結(jié)構(gòu)可以設(shè)想為三棱柱，其中每個(gè)三角形頂點(diǎn)代表一個(gè)螺旋，例如，如圖1中所示。在一些實(shí)施方案中，螺旋的任何2個(gè)組合限定3螺旋束蛋白的矩形面。例如，在一些實(shí)施方案中，3螺旋束蛋白的3個(gè)面由以下限定：

7、1)螺旋1和2(圖1中的面1、2)；

8、2)螺旋2和3(圖1中的面2、3)；

9、3)螺旋1和3(圖1中的面1、3)；以及

10、它們的組合。

11、在一些實(shí)施方案中，親和劑(或所述親和劑中包含的配體)包含由3螺旋束蛋白的螺旋2和3形成的面。在一些實(shí)施方案中，3螺旋束蛋白的螺旋1的主要功能是完成和穩(wěn)定3螺旋束。在一些實(shí)施方案中，可以對(duì)螺旋1進(jìn)行改變以維持3螺旋束蛋白的結(jié)構(gòu)。

12、在一些實(shí)施方案中，本文提供了包含seq?id?no:1——eqrrnfienlrwdpsksarllarakrfndw的親和劑。

13、在一些實(shí)施方案中，本文提供的包含seq?id?no:1的親和劑含在3螺旋束蛋白的螺旋2和3內(nèi)。

14、在一些實(shí)施方案中，本文提供了包含seq?id?no:2——vdakfdkeleearaeierlpnlteeqrrnfienlrwdpsksarllarakrfndwqapk的親和劑。

15、在一些實(shí)施方案中，本文提供了包含多聚體多肽的親和劑，所述多聚體多肽包含至少兩個(gè)亞基，每個(gè)亞基為根據(jù)前述實(shí)施方案的多肽。

16、在一些實(shí)施方案中，本文提供了包含多聚體多肽的親和劑，其中所述亞基并非全部相同。

17、在一些實(shí)施方案中，本文提供了包含seq?id?no:3-10的親和劑。

18、在一些實(shí)施方案中，本文提供了與三聚化結(jié)構(gòu)域結(jié)合的親和劑。

19、在一些實(shí)施方案中，本文提供了用于純化含有三聚化結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)的親和劑。

20、在一些實(shí)施方案中，本文提供了用于純化含有三聚化結(jié)構(gòu)域的疫苗的親和劑。

21、定義

22、為了更容易地理解本公開，下面定義某些術(shù)語。除非本文另有定義，否則技術(shù)和科學(xué)術(shù)語具有與本領(lǐng)域普通技術(shù)人員通常所理解的相同的含義。

23、大約或約：如本文所用，術(shù)語“大約”或“約”當(dāng)應(yīng)用于一個(gè)或多個(gè)感興趣的值時(shí)，是指與所陳述的參考值相似的值。在某些實(shí)施方案中，術(shù)語“大約”或“約”是指以增加的優(yōu)選程度落在所陳述的參考值的任一方向(大于或小于)的25％、20％、19％、18％、17％、16％、15％、14％、13％、12％、11％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％或更小的范圍內(nèi)的一系列值，除非另有說明或另外從上下文顯而易見(除了這樣的數(shù)字將超過可能值的100％的情況外)。

24、生物活性：如本文所用，術(shù)語“生物活性”是指在生物系統(tǒng)中、特別是在生物體中具有活性的任何劑的特征。例如，當(dāng)施用于生物體時(shí)對(duì)該生物體具有生物作用的劑被認(rèn)為是生物活性的。

25、保守和非保守取代：“保守”氨基酸取代是其中一個(gè)氨基酸殘基被另一個(gè)具有相似側(cè)鏈的氨基酸殘基替換的取代。本領(lǐng)域已經(jīng)定義了具有類似側(cè)鏈的氨基酸殘基家族，包括堿性側(cè)鏈(例如，賴氨酸(k)、精氨酸(r)、組氨酸(h))；酸性側(cè)鏈(例如，天冬氨酸(d)、谷氨酸(e))；不帶電荷的極性側(cè)鏈(例如，天冬酰胺(n)、谷氨酰胺(q)、絲氨酸(s)、蘇氨酸(t)、酪氨酸(y)、半胱氨酸(c))；非極性側(cè)鏈(例如，甘氨酸(g)；丙氨酸(a)、纈氨酸(v)、亮氨酸(l)、異亮氨酸(i)、脯氨酸(p)、苯丙氨酸(f)、蛋氨酸(m)、色氨酸(w)、β-支鏈側(cè)鏈(例如，蘇氨酸(t)、纈氨酸(v)、異亮氨酸(i))；和芳族側(cè)鏈(例如，酪氨酸(y)、苯丙氨酸(f)、色氨酸(w)、組氨酸(h))。例如，用苯丙氨酸取代酪氨酸是一種保守取代。在一些實(shí)施方案中，配體序列中的保守氨基酸取代賦予或改善配體與感興趣的靶標(biāo)的特異性結(jié)合。在一些實(shí)施方案中，配體序列中的保守氨基酸取代不會(huì)減少或消除配體與感興趣的靶標(biāo)的結(jié)合。在一些實(shí)施方案中，保守氨基酸取代不會(huì)顯著影響配體與感興趣的靶標(biāo)的特異性結(jié)合。鑒定賦予、改變或保持選擇性結(jié)合親和力的核苷酸和氨基酸保守取代和非保守取代的方法是本領(lǐng)域已知的(參見例如brummell,biochem.32:1180-1187(1993)；kobayashi,protein?eng.12(10):879-884(1999)；和burks,pnas?94:412-417(1997))。在一些實(shí)施方案中，配體序列中的非保守氨基酸取代賦予或改善配體與感興趣的靶標(biāo)的特異性結(jié)合。在一些實(shí)施方案中，配體序列中的非保守氨基酸取代不會(huì)減少或消除配體與感興趣的靶標(biāo)的結(jié)合。在一些實(shí)施方案中，非保守氨基酸取代不會(huì)顯著影響配體與感興趣的靶標(biāo)的特異性結(jié)合。

26、接頭：如本文所用，“接頭”是指起到連接原本獨(dú)立的功能性結(jié)構(gòu)域、實(shí)體或部分的作用的肽或其他化學(xué)鍵聯(lián)。在一些實(shí)施方案中，接頭位于配體與含有原本獨(dú)立的功能性結(jié)構(gòu)域的另一多肽組分之間。在一些實(shí)施方案中，接頭為位于配體與表面(諸如固體表面或固體支持物)之間的肽或其他化學(xué)鍵聯(lián)。在特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，配體通過形成在配體的半胱氨酸(優(yōu)選地，n-或c-末端半胱氨酸，更優(yōu)選c-末端半胱氨酸)的硫醇基團(tuán)與固體支持物之間的鍵化學(xué)綴合(即，共價(jià)結(jié)合)到固體表面或固體支持物。例如，配體可通過由配體的半胱氨酸(例如，c-末端半胱氨酸)的硫醇基團(tuán)與固體表面或固體支持物上的馬來酰亞胺基團(tuán)的親核加成形成的鍵共價(jià)結(jié)合到固體支持物。用于將配體(例如，包含多肽的配體)共價(jià)或非共價(jià)連接到固體表面或固體支持物的其他方法是本領(lǐng)域眾所周知并常規(guī)采用的。例如，可以使用greg?t.hermanson,“bioconjugate?techniques”第3版(2013)(其全文以引用方式并入本文)中描述的任何方法和鍵聯(lián)來將配體共價(jià)結(jié)合到固體支持物。

27、天然存在的：當(dāng)與諸如核酸分子、多肽和宿主細(xì)胞等生物材料結(jié)合使用時(shí)，術(shù)語“天然存在的”是指自然界中存在且未經(jīng)人類修飾的那些。相反，當(dāng)與生物材料結(jié)合使用時(shí)，“非天然”或“合成”是指自然界中不存在和/或已經(jīng)人類修飾的那些。

28、“非天然氨基酸”、“氨基酸類似物”和“非標(biāo)準(zhǔn)氨基酸殘基”在本文中可互換使用?？稍谌绫疚乃峁┑呐潴w中被取代的非天然氨基酸是本領(lǐng)域已知的。在一些實(shí)施方案中，非天然氨基酸為可取代脯氨酸的4-羥脯氨酸；可取代賴氨酸的5-羥賴氨酸；可取代組氨酸的3-甲基組氨酸；可取代絲氨酸的高絲氨酸；和可取代賴氨酸的鳥氨酸。可在多肽配體中被取代的非天然氨基酸的另外的實(shí)例包括但不限于分子諸如：常見氨基酸的d-異構(gòu)體、2,4-二氨基丁酸、α-氨基異丁酸、a-氨基丁酸、abu、2-氨基丁酸、γ-abu、ε-ahx、6-氨基己酸、aib、2-氨基異丁酸、3-氨基丙酸、鳥氨酸、正亮氨酸、正纈氨酸、羥脯氨酸、肌氨酸、瓜氨酸、高瓜氨酸、半胱氨酸、叔丁基甘氨酸、叔丁基丙氨酸、苯基甘氨酸、環(huán)己基丙氨酸、β-丙氨酸、羊毛硫氨酸、脫氫丙氨酸、γ-氨基丁酸、硒代半胱氨酸和吡咯賴氨酸氟代氨基酸、設(shè)計(jì)師氨基酸諸如β-甲基氨基酸、cα-甲基氨基酸和nα-甲基氨基酸。

29、“多核苷酸”和“核酸分子”：如本文中可互換使用的，多核苷酸和核酸分子是指任何長(zhǎng)度的核苷酸的聚合形式，其包含核糖核苷酸或脫氧核糖核苷酸或兩者或者由其組成。這些術(shù)語包括但不限于dna、rna、cdna(互補(bǔ)dna)、mrna(信使rna)、rrna(核糖體rna)、shrna(小發(fā)夾rna)、snrna(小核rna)、snorna(短核仁rna)、mirna(微小rna)、基因組dna、合成dna、合成rna和/或trna。

30、可操作地連接：如本文所用，術(shù)語“可操作地連接”表示兩個(gè)分子附接以便各自保留功能活性。無論是直接附接還是間接附接，兩個(gè)分子都是“可操作地連接”的。

31、肽標(biāo)簽：如本文所用，術(shù)語“肽標(biāo)簽”是指為另一種蛋白質(zhì)的一部分或附接(例如通過基因工程改造)到另一種蛋白質(zhì)以為由此產(chǎn)生的融合提供功能的肽序列。與它們?nèi)诤系牡鞍踪|(zhì)相比，肽標(biāo)簽通常相對(duì)較短。在一些實(shí)施方案中，肽標(biāo)簽的長(zhǎng)度為四個(gè)或更多個(gè)氨基酸，諸如5、6、7、8、9、10、15、20或25個(gè)或更多個(gè)氨基酸。在一些實(shí)施方案中，配體為含有肽標(biāo)簽的蛋白質(zhì)。具有如本文所提供的用途的許多肽標(biāo)簽是本領(lǐng)域已知的?？梢允桥潴w融合蛋白的組分或由配體結(jié)合的靶標(biāo)(例如，配體融合蛋白)的肽標(biāo)簽的實(shí)例包括但不限于ha(血凝素)、c-myc、單純皰疹病毒糖蛋白d(gd)、t7、gst、gfp、mbp、strep標(biāo)簽、his標(biāo)簽、myc標(biāo)簽、tap標(biāo)簽和flag標(biāo)簽(eastman?kodak,rochester,n.y.)。同樣，針對(duì)標(biāo)簽表位的抗體允許在例如親和純化、蛋白質(zhì)印跡、elisa測(cè)定和細(xì)胞免疫染色中檢測(cè)和定位融合蛋白。

32、多肽：如本文所用，術(shù)語“多肽”是指經(jīng)由肽鍵連接在一起的連續(xù)氨基酸鏈。該術(shù)語用于指任何長(zhǎng)度的氨基酸鏈，但本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員將理解，該術(shù)語不限于長(zhǎng)鏈，而是可以指包含經(jīng)由肽鍵連接在一起的兩個(gè)氨基酸的最小鏈。因此，為了本公開，應(yīng)理解，術(shù)語“肽”和“多肽”可互換使用。如本領(lǐng)域技術(shù)人員所知，多肽可被加工和/或修飾。

33、蛋白質(zhì)：如本文所用術(shù)語“蛋白質(zhì)”是指一種或多種充當(dāng)離散單元的多肽。如果單個(gè)多肽為離散的功能單元并且不需要與其他多肽永久或暫時(shí)的物理締合以形成離散的功能單元，則術(shù)語“多肽”和“蛋白質(zhì)”可互換使用。如果離散的功能單元由多于一種彼此物理締合的多肽組成，則術(shù)語“蛋白質(zhì)”是指物理偶聯(lián)并作為離散單元一起發(fā)揮作用的多個(gè)多肽。

34、特異性結(jié)合：如本文所用，關(guān)于配體，術(shù)語“特異性結(jié)合”或“對(duì)……具有選擇性親和力”意指配體相比于與替代物質(zhì)(包括不相關(guān)的蛋白質(zhì))的反應(yīng)或締合更頻繁地、更快速地、以更長(zhǎng)的持續(xù)時(shí)間、以更大的親和力或以上的組合與特定表位、蛋白質(zhì)或靶分子反應(yīng)或締合。由于不同物種中同源蛋白質(zhì)之間的序列同一性，故特異性結(jié)合可包括識(shí)別多于一個(gè)物種中的蛋白質(zhì)或靶標(biāo)的結(jié)合劑。同樣，由于不同蛋白質(zhì)的多肽序列的某些區(qū)域內(nèi)的同源性，故特異性結(jié)合可包括識(shí)別多于一種蛋白質(zhì)或靶標(biāo)的結(jié)合劑。應(yīng)理解，在某些實(shí)施方案中，特異性結(jié)合第一靶標(biāo)的結(jié)合劑可能會(huì)或可能不會(huì)特異性結(jié)合第二靶標(biāo)。因此，“特異性結(jié)合”不一定需要(盡管其可包括)排他性結(jié)合，即與單一靶標(biāo)結(jié)合。因此，在某些實(shí)施方案中，配體或親和劑可特異性結(jié)合多于一個(gè)靶標(biāo)。在某些實(shí)施方案中，多個(gè)靶標(biāo)可被親和劑上的相同抗原結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合。

35、基本上：如本文所用，術(shù)語“基本上”是指表現(xiàn)出總體或接近總體范圍或程度的感興趣的特征或性質(zhì)的定性情況。生物學(xué)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)理解，生物學(xué)以及化學(xué)現(xiàn)象很少(如果有的話)會(huì)達(dá)到完全和/或進(jìn)行到完全或者實(shí)現(xiàn)或避免絕對(duì)的結(jié)果。因此，術(shù)語“基本上”在本文中用于獲得在許多生物學(xué)以及化學(xué)現(xiàn)象中固有的完全性的潛在缺乏。

36、還應(yīng)理解，當(dāng)本文提及單數(shù)“名詞”(例如，配體(a?ligand)、珠粒(a?bead)等)時(shí)，除非另有說明，否則此類術(shù)語的復(fù)數(shù)形式(例如，配體(ligands)、珠粒(beads)等)優(yōu)選意在也包括并設(shè)想在本文中。因此，在優(yōu)選的實(shí)施方案中，在適用的情況下，提及單數(shù)名詞也旨在替代地提及“至少一個(gè)”、“一個(gè)或多個(gè)”或“多個(gè)”所提及的術(shù)語。