本發(fā)明涉及微生物領(lǐng)域。更具體地說(shuō)，本發(fā)明涉及一株凝結(jié)魏茨曼氏菌及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
1、傷口愈合是生物體維持組織完整性和功能恢復(fù)的重要生理過(guò)程。在臨床實(shí)踐中，慢性傷口、燒傷及術(shù)后創(chuàng)面等復(fù)雜傷口的處理仍面臨諸多挑戰(zhàn)。現(xiàn)有技術(shù)中常用的治療手段主要包括局部抗生素應(yīng)用、生長(zhǎng)因子制劑及物理敷料等，但這些方法在長(zhǎng)期實(shí)踐中逐漸暴露出技術(shù)局限性。
2、傳統(tǒng)抗生素治療雖能有效抑制細(xì)菌感染，但隨著耐藥菌株的廣泛出現(xiàn)，其治療效果顯著降低。臨床數(shù)據(jù)顯示，金黃色葡萄球菌等常見傷口感染菌對(duì)β-內(nèi)酰胺類抗生素的耐藥率已超過(guò)60%，迫使治療中不得不使用更高劑量或廣譜抗生素，這不僅增加肝腎毒性風(fēng)險(xiǎn)，還可能破壞傷口微生態(tài)平衡。此外，抗生素?zé)o法直接促進(jìn)上皮細(xì)胞遷移和血管新生等關(guān)鍵愈合過(guò)程，導(dǎo)致其在無(wú)感染傷口的治療中作用有限。
3、重組生長(zhǎng)因子類藥物（如pdgf、egf）雖能直接刺激細(xì)胞增殖，但其應(yīng)用存在明顯缺陷。這類蛋白分子在傷口滲液環(huán)境中易被蛋白酶降解，半衰期通常不足6小時(shí)，需要頻繁給藥維持有效濃度。更關(guān)鍵的是，工業(yè)化生產(chǎn)的生長(zhǎng)因子制劑純度要求高，生產(chǎn)成本達(dá)每毫克數(shù)千美元，嚴(yán)重制約臨床普及。有研究指出，某些生長(zhǎng)因子在慢性傷口中的異常表達(dá)反而可能促進(jìn)纖維化瘢痕形成。
4、基于上述技術(shù)局限，研究者已經(jīng)開始關(guān)注用胞外囊泡（evs）作為新型治療載體，并將其應(yīng)用在促進(jìn)傷口愈合的產(chǎn)品中，但基于凝結(jié)魏茨曼氏菌的胞外囊泡在促進(jìn)傷口愈合方面的應(yīng)用，目前還未見報(bào)道。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
1、本發(fā)明的目的是提供一株凝結(jié)魏茨曼氏菌及其應(yīng)用，以至少解決上述問題。
2、為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的和其它優(yōu)點(diǎn)，提供了一株凝結(jié)魏茨曼氏菌l-b15，其分類命名為：凝結(jié)魏茨曼氏菌( weizmannia?coagulans)，菌株凝結(jié)魏茨曼氏菌( weizmannia? coagulans)l-b15被保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心（cgmcc），保藏時(shí)間為：2025年01月23日，保藏編號(hào)為：cgmcc?no.33496，保藏單位地址為：北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)。
3、本發(fā)明還提供了一種上述的凝結(jié)魏茨曼氏菌在制備用于促進(jìn)傷口愈合的產(chǎn)品中的應(yīng)用。
4、優(yōu)選的是，所述產(chǎn)品的唯一活性成分為所述凝結(jié)魏茨曼氏菌的胞外囊泡，所述胞外囊泡的有效濃度為5×107~5×108顆粒/毫升。
5、優(yōu)選的是，所述胞外囊泡由如下步驟制備而成：步驟一、將凝結(jié)魏茨曼氏菌l-b15接種于含0.5-1.5g/l酵母提取物、2-4g/l蛋白胨、0.3-0.7g/l氯化鈉以及5-15g/l葡萄糖的液體培養(yǎng)基中，在45-55℃條件下進(jìn)行厭氧培養(yǎng)48-72小時(shí)，得到初始發(fā)酵液；步驟二、將初始發(fā)酵液以8000-12000g離心8-15分鐘去除菌體，收集上清液；將上清液依次通過(guò)0.45μm孔徑的聚醚砜膜和0.22μm孔徑的聚偏氟乙烯膜進(jìn)行過(guò)濾；將過(guò)濾后的上清液在4-8℃條件下以100000-150000g超速離心60-90分鐘，棄去上清后獲得初級(jí)囊泡沉淀；步驟三、將初級(jí)囊泡沉淀重懸于ph?7.9-8.5的磷酸鹽緩沖液中，加入終濃度為5-10?m?mol/l的氯化鈣溶液，在35-42℃水浴中震蕩孵育20-40分鐘；將孵育后的混合液進(jìn)行梯度蔗糖密度離心，依次疊加質(zhì)量分?jǐn)?shù)為15%、30%以及45%的蔗糖溶液，在4-8℃條件下以80000-100000g離心2-4小時(shí)，收集位于30%-45%蔗糖層界面的囊泡組分；步驟四、將收集的囊泡組分與含0.05-0.2?mol/l海藻糖的tris-hcl緩沖液混合，通過(guò)孔徑為100-200nm的聚碳酸酯膜反復(fù)擠出3-5次；將擠出后的混合液在4-8℃條件下以100000-150000?g超速離心60-90分鐘，收集沉淀物并用ph為7.4-7.6的tris-hcl緩沖液洗滌兩次，沉淀物即為胞外囊泡。
6、優(yōu)選的是，所述胞外囊泡的制備方法還包括：步驟五、將洗滌后的沉淀物與含0.05-0.2mol/l海藻糖和0.05-0.1?mol/l甘露醇的凍存保護(hù)劑混合，所述混合步驟在冰浴條件下以200-400rpm持續(xù)震蕩10-20分鐘，分裝體積為0.5-1.5?ml/管，并使用壁厚1.2-1.8mm的聚丙烯凍存管，分裝后以每分鐘降低1-2℃的速率預(yù)冷至-40℃，再轉(zhuǎn)移至-80℃保存。
7、本發(fā)明還提供了一種促進(jìn)傷口愈合的產(chǎn)品，所述產(chǎn)品以上述的凝結(jié)魏茨曼氏菌的胞外囊泡為唯一活性成分，且所述胞外囊泡的有效濃度為5×107~5×108顆粒/毫升。
8、本發(fā)明至少包括以下有益效果：
9、第一、首次將特定菌株的凝結(jié)魏茨曼氏菌的胞外囊泡應(yīng)用在促傷口愈合產(chǎn)品中，利用微生物天然代謝產(chǎn)物促進(jìn)愈合，可減少化學(xué)合成藥物或重組蛋白的毒副作用，且微生物來(lái)源成分更易與宿主微環(huán)境相容。這一應(yīng)用方向?yàn)殚_發(fā)非抗生素依賴型、微生態(tài)友好的創(chuàng)面治療策略提供了新路徑。
10、第二、通過(guò)限定產(chǎn)品的唯一活性成分為胞外囊泡并明確其濃度范圍，顯著提高了治療靶向性，降低了臨床應(yīng)用時(shí)的過(guò)敏或毒性風(fēng)險(xiǎn)。通過(guò)控制囊泡濃度在特定區(qū)間，既能確保有效激活細(xì)胞遷移，又可規(guī)避高劑量可能引發(fā)的過(guò)度炎癥反應(yīng)。
11、第三、通過(guò)特定培養(yǎng)基配方與分級(jí)純化工藝的結(jié)合，實(shí)現(xiàn)了高純度胞外囊泡的高效制備。厭氧培養(yǎng)條件與定制營(yíng)養(yǎng)配比可誘導(dǎo)菌株分泌特定功能分子，同時(shí)抑制無(wú)關(guān)代謝產(chǎn)物的生成。多級(jí)膜過(guò)濾與梯度離心聯(lián)用技術(shù)有效去除了培養(yǎng)基殘留物和細(xì)菌碎片，顯著提升囊泡純度。鈣離子輔助孵育與緩沖液擠出處理優(yōu)化了囊泡的分散性和膜完整性，確保了囊泡的活性。該制備方法在保證囊泡生物活性的同時(shí)，提高了批次間一致性，為工業(yè)化生產(chǎn)提供了可行性路徑。
12、第四、通過(guò)凍存保護(hù)劑配方與程序化降溫工藝的結(jié)合，解決了微生物囊泡長(zhǎng)期保存的技術(shù)難題。海藻糖與甘露醇的協(xié)同作用可在冷凍過(guò)程中形成玻璃態(tài)基質(zhì)，減少冰晶對(duì)囊泡膜的機(jī)械損傷。特定厚度凍存管與控速預(yù)冷設(shè)計(jì)降低了溫度驟變導(dǎo)致的脂質(zhì)雙分子層相變風(fēng)險(xiǎn)，維持囊泡結(jié)構(gòu)的完整性。該保存方法使囊泡制劑在-80℃條件下可穩(wěn)定儲(chǔ)存數(shù)月，活性損失率顯著低于常規(guī)冷凍干燥法，同時(shí)避免了反復(fù)凍融對(duì)制劑的破壞，保障了臨床使用時(shí)的療效可靠性。
13、本發(fā)明的其它優(yōu)點(diǎn)、目標(biāo)和特征將部分通過(guò)下面的說(shuō)明體現(xiàn)，部分還將通過(guò)對(duì)本發(fā)明的研究和實(shí)踐而為本領(lǐng)域的技術(shù)人員所理解。
1.凝結(jié)魏茨曼氏菌l-b15，其特征在于，其分類命名為：凝結(jié)魏茨曼氏菌(weizmannia?coagulans)，菌株凝結(jié)魏茨曼氏菌(weizmannia?coagulans)l-b15被保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心（cgmcc），保藏時(shí)間為：2025年01月23日，保藏編號(hào)為：cgmcc?no.33496，保藏單位地址為：北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)。
2.如權(quán)利要求1所述的凝結(jié)魏茨曼氏菌在制備用于促進(jìn)傷口愈合的產(chǎn)品中的應(yīng)用。
3.如權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于，所述產(chǎn)品的唯一活性成分為所述凝結(jié)魏茨曼氏菌的胞外囊泡，所述胞外囊泡的有效濃度為5×107~5×108?顆粒/毫升。
4.如權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于，所述胞外囊泡由如下步驟制備而成：
5.如權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，其特征在于，所述胞外囊泡的制備方法還包括：步驟五、將洗滌后的沉淀物與含0.05-0.2mol/l海藻糖和0.05-0.1?mol/l甘露醇的凍存保護(hù)劑混合，所述混合步驟在冰浴條件下以200-400rpm持續(xù)震蕩10-20分鐘，分裝體積為0.5-1.5?ml/管，并使用壁厚1.2-1.8?mm的聚丙烯凍存管，分裝后以每分鐘降低1-2℃的速率預(yù)冷至-40℃，再轉(zhuǎn)移至-80℃保存。
6.促進(jìn)傷口愈合的產(chǎn)品，其特征在于，所述產(chǎn)品以如權(quán)利要求1所述的凝結(jié)魏茨曼氏菌的胞外囊泡為唯一活性成分，且所述胞外囊泡的有效濃度為5×107~5×108?顆粒/毫升。