本發(fā)明涉及病毒保存，尤其是涉及一種錦鯉皰疹病毒的低溫凍存保護(hù)液及其制備方法和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
1、錦鯉皰疹病毒（khv）屬于皰疹病毒屬（ herpesviridae），魚類皰疹病毒科（ alloherpesviridae），也稱為鯉皰疹病毒3型（cyprinid?herpesvirus?3,?cyhv-3）；病毒顆粒呈球形，直徑約170~230?nm，具雙層脂質(zhì)包膜，基因組為線性雙鏈dna（~295?kbp），編碼超過150種蛋白。其高致病及傳染性給國(guó)內(nèi)外普通鯉魚及錦鯉養(yǎng)殖帶來巨大損失，滅活疫苗效果欠佳，難以產(chǎn)業(yè)化，活疫苗其效果顯著，并且可以實(shí)現(xiàn)大規(guī)模浸泡免疫，但是其產(chǎn)業(yè)化對(duì)活病毒的保存要求極高。
2、目前，khv凍存多采用基于胎牛血清、二甲基亞砜或甘油的通用配方，且基本都要保存在-80℃超低溫條件下。由于淡水或海水魚體液的滲透壓差異大，現(xiàn)有緩沖液（如pbs）難適配，出現(xiàn)滲透壓失衡；且傳統(tǒng)梯度降溫易導(dǎo)致病毒包膜破裂，數(shù)據(jù)顯示khv凍存后活性＜50%。
3、有鑒于此，特提出本發(fā)明。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
1、本發(fā)明的目的之一在于提供一種錦鯉皰疹病毒的低溫凍存保護(hù)液，以解決現(xiàn)有技術(shù)中凍存液需要在超低溫條件下保存，且存在滲透壓失衡及病毒包膜破裂，凍存復(fù)蘇后活性低的技術(shù)問題。
2、本發(fā)明的目的之二在于提供上述的低溫凍存保護(hù)液的制備方法。
3、本發(fā)明的目的之三在于提供上述的低溫凍存保護(hù)液的應(yīng)用。
4、本發(fā)明的目的之四在于提供一種用于錦鯉皰疹病毒凍存的產(chǎn)品。
5、本發(fā)明的目的之五在于提供一種錦鯉皰疹病毒的凍存方法。
6、為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的上述目的，特采用以下技術(shù)方案：
7、第一方面，本發(fā)明提供了一種錦鯉皰疹病毒的低溫凍存保護(hù)液，包括2~8w/v%的羥乙基淀粉、3~5w/v%的蔗糖和1~3w/v%的牛血清蛋白。
8、進(jìn)一步的，包括羥乙基淀粉的濃度為5w/v%，所述蔗糖的濃度為4w/v%，所述牛血清蛋白的濃度為2w/v%。
9、進(jìn)一步的，ph為7.0~8.0。
10、進(jìn)一步的，所述低溫凍存保護(hù)液的溶劑的鹽度為7~12‰；
11、所述溶劑包括6~12g/l的nacl、0.2~0.5g/l的kcl和0.1~0.3g/l?cacl2。
12、第二方面，本發(fā)明提供了上述的低溫凍存保護(hù)液的制備方法，包括將蔗糖和羥乙基淀粉溶解于溶劑，加入牛血清蛋白制得低溫凍存保護(hù)液。
13、進(jìn)一步的，所述將蔗糖和羥乙基淀粉溶解于溶劑之前還包括預(yù)熱溶劑至32~37℃；
14、所述加入牛血清蛋白之后還包括濾膜除菌。
15、第三方面，本發(fā)明提供了上述的低溫凍存保護(hù)液或上述的制備方法制得的低溫凍存保護(hù)液在錦鯉皰疹病毒凍存或制備用于錦鯉皰疹病毒凍存的產(chǎn)品中的應(yīng)用。
16、第四方面，本發(fā)明提供了一種用于錦鯉皰疹病毒凍存的產(chǎn)品，包括上述的低溫凍存保護(hù)液或上述的制備方法制得的低溫凍存保護(hù)液。
17、第五方面，本發(fā)明提供了一種錦鯉皰疹病毒的凍存方法，包括將低溫凍存保護(hù)液與病毒懸液混合，依次經(jīng)4℃預(yù)冷，降溫至-20℃后經(jīng)液氮深凍；
18、所述低溫凍存保護(hù)液與上述的低溫凍存保護(hù)液或上述的制備方法制得的低溫凍存保護(hù)液。
19、進(jìn)一步的，所述低溫凍存保護(hù)液與病毒懸液的體積比為1:1；
20、所述預(yù)冷的時(shí)間為20~40min；
21、4℃至-20℃的降溫速率為0.8~1.2℃/min；
22、所述液氮深凍的時(shí)間≥2h。
23、本發(fā)明提供的一種錦鯉皰疹病毒的低溫凍存保護(hù)液，將羥乙基淀粉和低濃度的蔗糖聯(lián)用，減少冰晶形成穩(wěn)定病毒包膜，避免病毒包膜破裂。實(shí)驗(yàn)證明，與傳統(tǒng)配方相比，經(jīng)本發(fā)明提供的低溫凍存保護(hù)液保存的錦鯉皰疹病毒在復(fù)蘇后活性≥90%，可耐受5次凍融循環(huán)，可穩(wěn)定凍存在-20℃，保存期延長(zhǎng)至2年。解決了現(xiàn)有技術(shù)中凍存液需要在超低溫條件下保存，且存在滲透壓失衡及病毒包膜破裂，凍存復(fù)蘇后活性低的技術(shù)問題。
1.一種錦鯉皰疹病毒的低溫凍存保護(hù)液，其特征在于，包括2~8w/v%的羥乙基淀粉、3~5w/v%的蔗糖和1~3w/v%的牛血清蛋白。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的低溫凍存保護(hù)液，其特征在于，包括羥乙基淀粉的濃度為5w/v%，所述蔗糖的濃度為4w/v%，所述牛血清蛋白的濃度為2w/v%。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的低溫凍存保護(hù)液，其特征在于，ph為7.0~8.0。
4.根據(jù)權(quán)利要求1~3任一項(xiàng)所述的低溫凍存保護(hù)液，其特征在于，所述低溫凍存保護(hù)液的溶劑的鹽度為7~12‰；
5.權(quán)利要求1~4任一項(xiàng)所述的低溫凍存保護(hù)液的制備方法，其特征在于，包括將蔗糖和羥乙基淀粉溶解于溶劑，加入牛血清蛋白制得低溫凍存保護(hù)液。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的制備方法，其特征在于，所述將蔗糖和羥乙基淀粉溶解于溶劑之前還包括預(yù)熱溶劑至32~37℃；
7.權(quán)利要求1~4任一項(xiàng)所述的低溫凍存保護(hù)液或權(quán)利要求5或6所述的制備方法制得的低溫凍存保護(hù)液在錦鯉皰疹病毒凍存或制備用于錦鯉皰疹病毒凍存的產(chǎn)品中的應(yīng)用。
8.一種用于錦鯉皰疹病毒凍存的產(chǎn)品，其特征在于，包括權(quán)利要求1~4任一項(xiàng)所述的低溫凍存保護(hù)液或權(quán)利要求5或6所述的制備方法制得的低溫凍存保護(hù)液。
9.一種錦鯉皰疹病毒的凍存方法，其特征在于，包括將低溫凍存保護(hù)液與病毒懸液混合，依次經(jīng)4℃預(yù)冷，降溫至-20℃后經(jīng)液氮深凍；
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的凍存方法，其特征在于，所述低溫凍存保護(hù)液與病毒懸液的體積比為1:1；