本發(fā)明涉及用于生物技術(shù)研究的工具，特別是用于快速且有效地開(kāi)發(fā)針對(duì)感興趣分析物的定制多重測(cè)定面板(panel)的產(chǎn)品和方法。本發(fā)明在開(kāi)發(fā)用于蛋白質(zhì)組學(xué)研究領(lǐng)域的靈活面板中特別有用。
背景技術(shù)：
1、現(xiàn)代蛋白質(zhì)組學(xué)方法需要在小樣品體積中檢測(cè)大量不同蛋白質(zhì)(或蛋白質(zhì)復(fù)合物)的能力。為了實(shí)現(xiàn)這一點(diǎn)，必須進(jìn)行多重分析?？蓪?shí)現(xiàn)樣品中蛋白質(zhì)的多重檢測(cè)的常用方法包括鄰近延伸測(cè)定(pea)和鄰近連接測(cè)定(pla)。pea和pla描述于wo?01/61037中；pea進(jìn)一步描述于wo?03/044231、wo?2004/094456、wo?2005/123963、wo?2006/137932、wo2013/113699、wo?2021/191442、wo?2021/191448、wo?2021/191449、wo?2022/191450和wo2022/112300；assarsson等人，plos1,2014,9,4,e95192；lundberg等人，molecular&cellular?proteomics10:10.1074/mcp.m110.004978,1–10,2011；和wik等人，2021,molcell?proteomics?20,100168中，所有文獻(xiàn)全文以引用方式并入本文中。
2、當(dāng)感興趣蛋白質(zhì)在通常情況下以寬濃度范圍存在時(shí)，這提出了挑戰(zhàn)，因?yàn)閬?lái)自高濃度蛋白質(zhì)的信號(hào)可能淹沒(méi)來(lái)自低濃度蛋白質(zhì)的信號(hào)，導(dǎo)致不能檢測(cè)以較低濃度存在的蛋白質(zhì)。
3、pea和pla是鄰近測(cè)定，其依賴(lài)于“鄰近探測(cè)”的原理。在這些方法中，通過(guò)多個(gè)(即兩個(gè)或更多個(gè)、通常兩個(gè)或三個(gè))探針的結(jié)合來(lái)檢測(cè)分析物，這些探針當(dāng)通過(guò)與分析物結(jié)合而變得鄰近時(shí)(因此為“鄰近探針”)，允許產(chǎn)生信號(hào)。通常，鄰近探針中的至少一個(gè)探針包含與探針的分析物結(jié)合結(jié)構(gòu)域(或部分)連接的核酸結(jié)構(gòu)域(或部分)，并且信號(hào)的產(chǎn)生涉及核酸部分和/或由其他探針攜帶的另一功能部分之間的相互作用。因此，信號(hào)產(chǎn)生依賴(lài)于探針之間的相互作用(更具體地，核酸或由探針攜帶的其他功能部分/結(jié)構(gòu)域之間的相互作用)，并且因此僅在必要的探針已經(jīng)與分析物結(jié)合時(shí)發(fā)生，從而賦予檢測(cè)系統(tǒng)改進(jìn)的特異性。
4、在pea中，當(dāng)探針處于緊密鄰近時(shí)(即當(dāng)與相同目標(biāo)分子結(jié)合時(shí)，或與處于緊密鄰近的目標(biāo)分子結(jié)合時(shí)，例如在復(fù)合物、相互作用物或聚集體中，或當(dāng)兩個(gè)分子緊密共定位時(shí))，與探針對(duì)的分析物結(jié)合結(jié)構(gòu)域連接的核酸部分彼此雜交，然后使用核酸聚合酶延伸。延伸產(chǎn)物形成報(bào)告核酸，對(duì)該報(bào)告核酸的檢測(cè)證明感興趣樣品中特定分析物(由相關(guān)探針對(duì)結(jié)合的分析物)的存在。在pla中，當(dāng)探針對(duì)的探針結(jié)合它們的目標(biāo)時(shí)，與探針對(duì)的分析物結(jié)合結(jié)構(gòu)域連接的核酸部分變得鄰近，并且可以連接在一起，或者另選地，它們可以一起形成單獨(dú)添加的寡核苷酸的連接的模板，該寡核苷酸能夠在核酸結(jié)構(gòu)域處于鄰近時(shí)與核酸結(jié)構(gòu)域雜交。連接產(chǎn)物然后被擴(kuò)增，充當(dāng)報(bào)告核酸。使用pea或pla的多重分析物檢測(cè)可以通過(guò)在每個(gè)探針的核酸部分中包括唯一的條形碼序列來(lái)實(shí)現(xiàn)。對(duì)應(yīng)于特定分析物的報(bào)告核酸分子可以通過(guò)其包含的條形碼序列來(lái)鑒定。發(fā)現(xiàn)本發(fā)明的方法在多重pea和pla方法中特別有用。
5、如上所述的鄰近測(cè)定的面板可從olink?proteomics?ab(uppsala,sweden)以商品名target、focus和explore商購(gòu)獲得。這些是多達(dá)92個(gè)測(cè)定(target和focus)的固定面板或分成八個(gè)不同面板的多達(dá)約3,000個(gè)測(cè)定(explore)。每個(gè)面板通常包括針對(duì)在體內(nèi)的某些生物或生理區(qū)域、通路或器官內(nèi)具有已知功能的蛋白質(zhì)(諸如炎癥、器官特異性蛋白質(zhì)、心血管、神經(jīng)學(xué)等)的測(cè)定。
6、enroth等人，communications?biology?2(1),2019，第1-12頁(yè)(doi:10.1038/s42003-019-0464-9)描述了在pea測(cè)定中使用olink面板和定制設(shè)計(jì)的面板來(lái)鑒定用于卵巢癌的新的高準(zhǔn)確度血漿蛋白生物標(biāo)志物標(biāo)記。
7、當(dāng)前可商購(gòu)獲得的允許用戶(hù)將單個(gè)測(cè)定組合成多重測(cè)定的免疫測(cè)定具有80％至90％的可組合性。即，由于技術(shù)限制，10％至20％的理論上可能的組合多重面板是不可用的。此外，即使這些測(cè)定是可組合的，它們也可能需要在單獨(dú)的反應(yīng)容器中進(jìn)行。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
1、本發(fā)明如所附權(quán)利要求書(shū)所述。
1.一種文庫(kù)，所述文庫(kù)包含適用于檢測(cè)一組感興趣分析物的多個(gè)檢測(cè)探針，每個(gè)檢測(cè)探針包含分析物特異性結(jié)合結(jié)構(gòu)域和核酸部分，檢測(cè)探針的所述核酸部分能夠產(chǎn)生包含鑒定相應(yīng)感興趣分析物的鑒定序列的報(bào)告核酸分子，所述文庫(kù)的特征在于，對(duì)于一種或多種感興趣分析物，所述文庫(kù)包含一組兩個(gè)或更多個(gè)檢測(cè)探針，其中所述一組內(nèi)的每個(gè)檢測(cè)探針能夠產(chǎn)生包含與由同一組的其他成員產(chǎn)生的鑒定序列不同的鑒定序列的報(bào)告核酸分子。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的文庫(kù)，其中每個(gè)檢測(cè)探針包含一對(duì)匹配的鄰近探針，每個(gè)鄰近探針包含分析物特異性結(jié)合結(jié)構(gòu)域和核酸部分，每對(duì)匹配的鄰近探針的兩個(gè)分析物特異性結(jié)合結(jié)構(gòu)域都能夠與相同的感興趣分析物特異性結(jié)合，并且一對(duì)匹配的鄰近探針的所述核酸部分能夠一起形成包含鑒定所述相應(yīng)感興趣分析物的鑒定序列的報(bào)告核酸分子。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的文庫(kù)，其中每組檢測(cè)探針包括五個(gè)或更少的檢測(cè)探針。
4.根據(jù)權(quán)利要求1至3中一項(xiàng)所述的文庫(kù)，其中所述文庫(kù)包含用于至少25％的所述感興趣分析物的一組兩個(gè)或更多個(gè)檢測(cè)探針。
5.根據(jù)權(quán)利要求1至4中任一項(xiàng)所述的文庫(kù)，其中所述文庫(kù)中唯一鑒定序列的數(shù)量小于所述一組感興趣分析物的成員的數(shù)量。
6.根據(jù)權(quán)利要求1至5中任一項(xiàng)所述的文庫(kù)，其中所述文庫(kù)適應(yīng)于選擇n重檢測(cè)探針面板，所述適應(yīng)包括在所述文庫(kù)中包括1.5n至10n個(gè)唯一鑒定序列。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的文庫(kù)，其中n是介于1與100之間的整數(shù)。
8.根據(jù)權(quán)利要求1至7中任一項(xiàng)所述的文庫(kù)，其中所述鑒定序列是qpcr引物的結(jié)合位點(diǎn)。
9.根據(jù)權(quán)利要求1至8中任一項(xiàng)所述的文庫(kù)，其中所述鑒定序列是條形碼序列。
10.根據(jù)權(quán)利要求1至9中任一項(xiàng)所述的文庫(kù)，其中所述一組感興趣分析物包括100至30,000種感興趣分析物。
11.一種用于構(gòu)成用于感興趣分析物群組的檢測(cè)探針面板的方法，所述感興趣分析物群組是較大的一組感興趣分析物的子組，所述方法包括從根據(jù)權(quán)利要求1至10中任一項(xiàng)所述的文庫(kù)中為所述分析物群組中的每種分析物選擇一個(gè)檢測(cè)探針以包括在所述面板中，使得每個(gè)所選擇的檢測(cè)探針能夠產(chǎn)生具有在所構(gòu)成的面板內(nèi)唯一的鑒定序列的報(bào)告核酸分子。
12.根據(jù)權(quán)利要求11所述的方法，其中所述檢測(cè)探針包括匹配的鄰近探針對(duì)。
13.計(jì)算機(jī)程序，所述計(jì)算機(jī)程序包括使計(jì)算機(jī)執(zhí)行根據(jù)權(quán)利要求11或12所述的方法的指令。