本發(fā)明屬于微生態(tài)制劑領(lǐng)域，具體涉及一種可用于生料固體發(fā)酵的保鮮菌粉及其制備工藝。
背景技術(shù)：
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隨著畜牧業(yè)的快速發(fā)展，飼料安全問題已成為養(yǎng)豬生產(chǎn)者和消費者關(guān)注的焦點。全價生飼料固體發(fā)酵飼料作為綠色、環(huán)保型飼料已成為當(dāng)今動物營養(yǎng)研究的熱點。
全價生飼料經(jīng)發(fā)酵后原料中的纖維素、碳水化合物、蛋白質(zhì)等大分子物質(zhì)降解成乳酸、氨基酸等小分子物質(zhì)，易于公豬消化和吸收，提高了飼料的轉(zhuǎn)化率。同時經(jīng)發(fā)酵后的濕鮮飼料富含各種維生素、抗菌素、促生長素等，并富含益生菌群，復(fù)合酶系等既有益于促進(jìn)豬的生長，又有益于公豬腸道微生態(tài)的平衡。
固體發(fā)酵全價生飼料具有廣闊的市場前景，但經(jīng)發(fā)酵后的濕鮮飼料由于水分含量大，營養(yǎng)豐富，其保質(zhì)期較短，嚴(yán)重影響了濕鮮飼料的廣泛使用。
本發(fā)明提供的植物乳桿菌KT-Lp9可高產(chǎn)乳酸、苯乳酸等天然抑制大腸桿菌、霉菌的物質(zhì)，可保證發(fā)酵后的濕鮮飼料在長期貯存過程中具有較好的品質(zhì)，為其在市場中廣泛使用提供質(zhì)量保證。
技術(shù)實現(xiàn)要素：
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為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供一種用于生料固體發(fā)酵的保鮮菌粉，該菌粉由植物乳桿菌制備，用于公豬全價生飼料固體發(fā)酵并能夠在發(fā)酵和貯藏過程中殺滅大腸桿菌和霉菌、降低濕鮮料黃曲霉毒素B1的含量、提高濕鮮料保質(zhì)期，且具有優(yōu)異的耐酸、耐膽鹽特性且能廣譜的抑制致病菌。
所述植物乳桿菌具體為植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum)KT-Lp9，該菌株已于2016年9月8日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(地址：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，中國科學(xué)院微生物研究所，郵編100101)，保藏編號CGMCC No.12950；
所述菌粉，具體制備方法如下：
(1)植物乳桿菌的活化和培養(yǎng)：
將冷凍保存的植物乳桿菌KT-Lp9接種于MRS液體培養(yǎng)基中，在溫度37℃下靜態(tài)培養(yǎng)18-22h，如此傳代培養(yǎng)2-3次得到活化發(fā)酵液；
所述的MRS液體培養(yǎng)基組成如下：10g蛋白胨、5g牛肉膏、4g酵母浸粉、20g葡萄糖、2g磷酸氫二鉀、5g乙酸鈉、2g檸檬酸三鈉、1mL吐溫80、0.2g硫酸鎂、0.05g硫酸錳加入1000mL蒸餾水，調(diào)節(jié)pH至6.5，121℃滅菌15min；
(2)菌粉制備：將上述發(fā)酵液離心后，添加菌種保護(hù)劑凍干成菌粉；
所述菌體與保護(hù)劑的混合質(zhì)量比為1：2，使其含KT-Lp9活菌數(shù)在3.0×1011cfu/g以上。
所述的保護(hù)劑為：脫脂奶粉10％、乳糖8％、谷氨酸鈉0.1％(m:v)，其余為水。
植物乳桿菌KT-Lp9菌粉在發(fā)酵飼料中的使用方法：
向飼料原料中加入自來水，使飼料含水量達(dá)到45％，以接種量為2×106cfu/g向生料中接種KT-Lp9菌粉稀釋液，充分混勻后，準(zhǔn)確稱取50g于真空包裝袋中，將包裝袋壓實排空空氣，用封口機將包裝袋封口，常溫發(fā)酵5天。
發(fā)酵飼料品質(zhì)檢測：分別取樣測定生料發(fā)酵起始、常溫發(fā)酵5天、常溫貯藏15天、30天、60天、90天、120天、150天、180天飼料樣品酵母菌、霉菌及大腸桿菌等微生物指標(biāo)。
有益效果：
本發(fā)明提供的植物乳桿菌KT-Lp9菌粉具有下述積極效果：
1、KT-Lp9具有廣譜抑制致病菌的優(yōu)良特性且菌株在pH2.5的人工模擬胃液中消化3h后繼續(xù)在pH8.0的人工腸液中消化8h，其存活率高達(dá)81.57％；
2、本發(fā)明通過植物乳桿菌KT-Lp9菌粉在全價生飼料固體發(fā)酵過程中的動態(tài)變化，在發(fā)酵過程中快速降低pH，乳酸菌活菌數(shù)快速增加，對生料中的酵母菌、霉菌、尤其對大腸桿菌具有安全殺滅效果，同時能夠降低生鮮料黃曲霉毒素的含量，更為重要的是經(jīng)發(fā)酵后的濕鮮料在長期貯存過程中其品質(zhì)能得到較好的保持。
具體實施方式：
下面結(jié)合實施例對本發(fā)明作進(jìn)一步說明：下述實施例只是說明性的，并不限制本發(fā)明的保護(hù)范圍。
下述實施例中的實驗方法，如無特別說明，均為常規(guī)方法。
實施1：KT-Lp9抑菌特性及其耐酸、耐膽鹽特性
將冷凍保存的植物乳桿菌KT-Lp9接種于MRS液體培養(yǎng)基中，在溫度37℃下靜態(tài)培養(yǎng)18h，如此傳代培養(yǎng)2次得到活化發(fā)酵液；
所述的MRS液體培養(yǎng)基組成如下：10g蛋白胨、5g牛肉膏、4g酵母浸粉、20g葡萄糖、2g磷酸氫二鉀、5g乙酸鈉、2g檸檬酸三鈉、1mL吐溫80、0.2g硫酸鎂、0.05g硫酸錳加入1000mL蒸餾水，調(diào)節(jié)pH至6.5，121℃滅菌15min；
在pH2.5(用1mol/L HCl調(diào)整)滅菌PBS緩沖液中，加入3.5g/L胃蛋白酶，用0.22μm的微孔濾膜過濾除菌，制成模擬胃液；將活化好的菌株離心收集菌體，加入與培養(yǎng)基等量的pH2.5模擬胃液，37℃培養(yǎng)3h，于0h、3h用MRS瓊脂培養(yǎng)基傾注法測定其活菌數(shù)。
在pH8.0(用0.1mol/L NaOH調(diào)整)滅菌PBS中，加入0.1％胰蛋白酶和1.8％牛膽鹽用0.22μm的微孔濾膜過濾除菌，制成模擬腸液；將模擬胃液中處理3h后的菌液，離心洗菌兩次收集菌體后，加入與之前模擬胃液等量的模擬腸液繼續(xù)37℃培養(yǎng)，于4h、8h用MRS瓊脂培養(yǎng)基傾注法測活菌數(shù)，試驗結(jié)果見表1：存活率＝[N1/N0]×100％(N0－0h活菌數(shù)；N1－經(jīng)模擬腸、胃液消化后的活菌數(shù))
表1 KT-Lp9人工模擬胃液和腸液的存活率
用瓊脂孔擴散法(Well-diffusion Agar Assay)測定植物乳桿菌KT-Lp9發(fā)酵液的抑菌效果：將滅菌后冷卻至50℃左右的MRS瓊脂培養(yǎng)基(20ml)與200μL腸道致病菌液(106cfu/ml)一起倒入平板混勻。待加有腸道致病菌的MRS瓊脂培養(yǎng)基冷卻凝固結(jié)實后，使用打孔器在平板上打出直徑8mm左右的孔。每孔加入100μL植物乳桿菌KT-Lp9發(fā)酵液，于4℃冰箱中擴散12h后37℃培養(yǎng)恒溫48h，觀測抑菌圈的大小。抑菌圈直徑大小使用游標(biāo)卡尺進(jìn)行測量(保留兩位有效數(shù)字)，實驗結(jié)果見表2：
表2 KT-Lp9發(fā)酵液中苯乳酸、4-羥基苯乳酸含量和抑菌特性
注：打孔器直徑為8mm
由表1、表2試驗結(jié)果可知，KT-Lp9具有廣譜抑制致病菌的優(yōu)良特性且菌株在pH2.5的人工模擬胃液中消化3h后繼續(xù)在pH8.0的人工腸液中消化8h，其存活率高達(dá)81.57％。
實施2：植物乳桿菌KT-Lp9菌粉可加速全價生飼料固體發(fā)酵
植物乳桿菌菌粉的制備：
(1)植物乳桿菌的活化和培養(yǎng)：
將冷凍保存的植物乳桿菌KT-Lp9接種于MRS液體培養(yǎng)基中，在溫度37℃下靜態(tài)培養(yǎng)22h，如此傳代培養(yǎng)3次得到活化發(fā)酵液；
所述的MRS液體培養(yǎng)基組成如下：10g蛋白胨、5g牛肉膏、4g酵母浸粉、20g葡萄糖、2g磷酸氫二鉀、5g乙酸鈉、2g檸檬酸三鈉、1mL吐溫80、0.2g硫酸鎂、0.05g硫酸錳加入1000mL蒸餾水，調(diào)節(jié)pH至6.5，121℃滅菌15min；
(2)菌粉制備：將上述發(fā)酵液離心后，添加菌種保護(hù)劑凍干成菌粉；
所述菌體與保護(hù)劑的混合質(zhì)量比為1：2，使其含KT-Lp9活菌數(shù)在4.0×1011cfu/g。
所述的保護(hù)劑為：脫脂奶粉10％、乳糖8％、谷氨酸鈉0.1％，其余為水。
生料固體發(fā)酵配方見表3(原料均為市售)，實驗組向混合均勻的全價生飼料中加入自來水，使飼料含水量達(dá)到45％，以接種量為2×106cfu/g向飼料中接種KT-Lp9稀釋后的菌粉，對照組加入等量的自來水，充分混勻后，分別準(zhǔn)確稱取50g實驗組和對照組飼料原料于包裝袋中，將包裝袋壓實盡量排空空氣，用封口機將包裝袋封口常溫發(fā)酵5天，發(fā)酵結(jié)束后取樣測定pH、酵母菌、霉菌、大腸桿菌及KT-Lp9活菌數(shù)；
表3 飼料組成(％)
從密封袋中分別準(zhǔn)確稱取25g發(fā)酵5天后的實驗組和對照組樣品于裝有玻璃珠的1000mL滅菌三角瓶中，加入225g滅菌蒸餾水，置于搖床上200r/min搖動20min，取1mL移液槍吸取1mL樣品加入到9mL盛有稀釋液的無菌試管中，按上述倍比稀釋方法稀釋至一定倍數(shù)時，采用MRS瓊脂培養(yǎng)基(加抗生素)，平板傾注，37℃厭氧培養(yǎng)48h后，對乳酸菌進(jìn)行計數(shù)；分別選用選擇性培養(yǎng)基對酵母菌、霉菌、大腸桿菌進(jìn)行選擇性計數(shù)(其中酵母菌和霉菌選擇用孟加拉紅培養(yǎng)基，30℃培養(yǎng)120h，大腸桿菌選擇用結(jié)晶紫中性紅膽鹽瓊脂培養(yǎng)24小時)。取適量上述發(fā)酵飼料10倍稀釋液測定pH值。平行實驗重復(fù)3次取平均值，結(jié)果見表4、表5。
表4 生料發(fā)酵添加植物乳桿菌前后乳酸菌和pH動態(tài)變化
注：同列肩標(biāo)不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)
表5 生料發(fā)酵添加植物乳桿菌前后酵母菌、霉菌和大腸桿菌的活菌數(shù)
由表4實驗結(jié)果可知，添加植物乳桿菌KT-Lp9的發(fā)酵飼料與對照組相比，發(fā)酵終點乳酸菌活菌數(shù)和pH與對照組相比均存在顯著性差異(P<0.05)，說明添加KT-Lp9可加速全價生飼料的固體發(fā)酵。
由表5實驗結(jié)果可知，酵母菌、霉菌在發(fā)酵前后實驗組與對照組活菌數(shù)均顯著降低(P＜0.05)，但發(fā)酵后實驗組酵母菌和霉菌活菌數(shù)均顯著低于對照組(P＜0.05)，說明植物乳桿菌KT-Lp9具有抑制生料發(fā)酵酵母菌和霉菌增長的效果；KT-Lp9對大腸桿菌具有殺滅效果，其在全價生飼料固體發(fā)酵過程中將具有廣泛的應(yīng)用前景。
實施3：KT-Lp9具有降解濕鮮料中黃曲霉毒素B1的作用
植物乳桿菌菌粉的制備：
(1)植物乳桿菌的活化和培養(yǎng)：
將冷凍保存的植物乳桿菌KT-Lp9接種于MRS液體培養(yǎng)基中，在溫度37℃下靜態(tài)培養(yǎng)20h，如此傳代培養(yǎng)3次得到活化發(fā)酵液；
所述的MRS液體培養(yǎng)基組成如下：10g蛋白胨、5g牛肉膏、4g酵母浸粉、20g葡萄糖、2g磷酸氫二鉀、5g乙酸鈉、2g檸檬酸三鈉、1mL吐溫80、0.2g硫酸鎂、0.05g硫酸錳加入1000mL蒸餾水，調(diào)節(jié)pH至6.5，121℃滅菌15min；
(2)菌粉制備：將上述發(fā)酵液離心后，添加菌種保護(hù)劑凍干成菌粉；
所述菌體與保護(hù)劑的混合質(zhì)量比為1：2，使其含KT-Lp9活菌數(shù)在5.0×1011cfu/g；
所述的保護(hù)劑為：脫脂奶粉10％、乳糖8％、谷氨酸鈉0.1％，其余為水；
生料固體發(fā)酵配方見表3(原料均為市售)，實驗組向混合均勻的全價生飼料中加入自來水，使飼料含水量達(dá)到45％，以接種量為2×106cfu/g向飼料中接種KT-Lp9稀釋后的菌粉，對照組加入等量的自來水，充分混勻后，分別準(zhǔn)確稱取50g實驗組和對照組飼料原料于包裝袋中，將包裝袋壓實盡量排空空氣，用封口機將包裝袋封口常溫發(fā)酵5天；
分別抽取發(fā)酵好的對照組與實驗組濕鮮料樣品，分別測定樣品中黃曲霉毒素B1的含量，采用黃曲霉毒素B1(AFB1)ELISA快速檢測試劑盒機型測定，結(jié)果見表6；
表6 濕鮮料中黃曲霉毒素B1的含量
由表6實驗結(jié)果可知，實驗組濕鮮料黃曲霉毒素B1顯著低于對照組，說明KT-Lp9具有降低濕鮮料黃曲霉毒素的作用，從而提高濕鮮料的飼用安全性。
實施4：KT-Lp9可提高濕鮮料貯藏穩(wěn)定性
植物乳桿菌菌粉的制備：
(1)植物乳桿菌的活化和培養(yǎng)：
將冷凍保存的植物乳桿菌KT-Lp9接種于MRS液體培養(yǎng)基中，在溫度37℃下靜態(tài)培養(yǎng)20h，如此傳代培養(yǎng)3次得到活化發(fā)酵液；
所述的MRS液體培養(yǎng)基組成如下：10g蛋白胨、5g牛肉膏、4g酵母浸粉、20g葡萄糖、2g磷酸氫二鉀、5g乙酸鈉、2g檸檬酸三鈉、1mL吐溫80、0.2g硫酸鎂、0.05g硫酸錳加入1000mL蒸餾水，調(diào)節(jié)pH至6.5，121℃滅菌15min；
(2)菌粉制備：將上述發(fā)酵液離心后，添加菌種保護(hù)劑凍干成菌粉；
所述菌體與保護(hù)劑的混合質(zhì)量比為1：2，使其含KT-Lp9活菌數(shù)在4.0×1011cfu/g；
所述的保護(hù)劑為：脫脂奶粉10％、乳糖8％、谷氨酸鈉0.1％，其余為水。
生料固體發(fā)酵配方見表3(原料均為市售)，向混合均勻的全價生飼料中加入自來水，使飼料含水量達(dá)到45％，以接種量為2×106cfu/g向飼料中接種KT-Lp9稀釋后的菌粉，充分混勻后，準(zhǔn)確稱取50g飼料原料于包裝袋中，將包裝袋壓實盡量排空空氣，用封口機將包裝袋封口常溫發(fā)酵5天；
將發(fā)酵好的濕鮮料常溫貯藏6個月，分別于15天、30天、60天、90天、120天、150天、180天取樣測定酵母菌、霉菌及大腸桿菌含量，結(jié)果見表7。
表7 濕鮮料貯藏過程中酵母菌、霉菌和大腸桿菌的活菌數(shù)
由表7實驗結(jié)果可知，濕鮮料在貯藏過程中，植物乳桿菌KT-Lp9對酵母菌有一定的抑制效果，對霉菌和大腸桿菌具有顯著的殺滅效果(P＜0.05)。
由上述實驗結(jié)果，植物乳桿菌KT-Lp9即可加速全價生飼料固體發(fā)酵，同時又能保證發(fā)酵好的濕鮮料在長期貯存過程中保持較好的品質(zhì)。這種優(yōu)異的特性為其在市場中廣泛應(yīng)用提供可能。