本發(fā)明涉及一種復(fù)合益生菌制劑，以及該復(fù)合益生菌制劑的具體應(yīng)用。

背景技術(shù)：

化療是治療癌癥的重要手段之一，但化療后不良反應(yīng)較多，尤其是胃腸道反應(yīng)，包括腸黏膜炎和惡心嘔吐等。接受常規(guī)劑量化療藥物的患者，臨床發(fā)病率為40%，而幾乎所有接受高劑量化療藥物的患者，都會(huì)出現(xiàn)腸黏膜炎。惡心嘔吐是化療的另一重要胃腸道反應(yīng)，主要是與化療后5-羥色胺（5-HT）釋放有關(guān)，發(fā)病率同樣較高，尤其是注射順鉑后幾乎達(dá)100%，這嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量及化療效果。胃腸道反應(yīng)更是患者推遲化療的重要原因，導(dǎo)致癌癥患者的死亡率大大增加。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明是為了解決現(xiàn)有技術(shù)所存在的上述不足，提出一種能夠有效降低化療后副作用的復(fù)合益生菌制劑，以及該種復(fù)合益生菌制劑的具體應(yīng)用。

本發(fā)明的技術(shù)解決方案是：一種用于降低化療后5-羥色胺副作用的復(fù)合益生菌制劑，其特征在于：所述的復(fù)合益生菌制劑由以下益生菌按照以下活菌數(shù)量比例混合而成：

短雙歧桿菌：嗜酸乳桿菌：干酪乳桿菌：嗜熱鏈球菌=1：1-3:1-3:1-3，且所述的復(fù)合益生菌制劑的總活菌數(shù)量為200-800億。

所述的復(fù)合益生菌制劑在制備防止化療后惡心嘔吐的藥物中的應(yīng)用。

所述的復(fù)合益生菌制劑在制備改善腸黏膜炎藥物中的應(yīng)用。

本發(fā)明同現(xiàn)有技術(shù)相比，具有如下優(yōu)點(diǎn)：

本種復(fù)合益生菌制劑，其所有的菌株均來(lái)源于人體，經(jīng)經(jīng)篩選、馴化和組方驗(yàn)證，安全性高，具有良好的生態(tài)互助性，安全性高，臨床應(yīng)用有保障。它能夠有效降低5-羥色胺的水平，同時(shí)還可以改善腸黏膜炎。因此這種復(fù)合益生菌制劑作為腸內(nèi)微生態(tài)營(yíng)養(yǎng)制劑，用于化療病人的腸內(nèi)營(yíng)養(yǎng)制劑的產(chǎn)品開發(fā)，其使用十分廣泛。它的活菌數(shù)用量大，屬于醫(yī)用食品，無(wú)劑量限制，無(wú)毒副作用，使用方便，可作為營(yíng)養(yǎng)組件和其他營(yíng)養(yǎng)素一起用于臨床病人的營(yíng)養(yǎng)治療，讓患者在平時(shí)飲食的過(guò)程中就能完成輔助治療，能夠大大減輕患者痛苦。

附圖說(shuō)明

圖1為各組大鼠平均高嶺土攝食量變化圖。

圖2為順鉑處理后模型組大鼠腸道菌群隨時(shí)間的改變，PCR-DGGE指紋分析圖譜(A)、主成分（PCA）分析(B)及UPGMA相似性聚類分析(C)。

注：本圖中，#1-#5為順鉑處理后0天模型組大鼠腸道菌群，#6-#10為順鉑處理后3天模型組大鼠腸道菌群，#11-#15為順鉑處理后6天模型組大鼠腸道菌群。

圖3 為順鉑處理后益生菌組大鼠腸道菌群隨時(shí)間的改變，PCR-DGGE指紋分析圖譜(A)、主成分（PCA）分析(B)及UPGMA相似性聚類分析(C)。

注：本圖中，#1-#5為順鉑處理后0天益生菌組大鼠腸道菌群，#6-#10為順鉑處理后3天益生菌組大鼠腸道菌群，#11-#15為順鉑處理后6天益生菌組大鼠腸道菌群。

圖4 比較順鉑處理后第3天模型組與益生菌組大鼠腸道菌群，PCR-DGGE指紋分析圖譜(A)、主成分（PCA）分析(B)及UPGMA相似性聚類分析(C)。

注：本圖中，#1-#5為順鉑處理后第3天模型組大鼠腸道菌群，#6-#10為順鉑處理后第3天益生菌組大鼠腸道菌群。

圖5為比較順鉑處理后第6天模型組與益生菌組大鼠腸道菌群，PCR-DGGE指紋分析圖譜(A)、主成分（PCA）分析(B)及UPGMA相似性聚類分析(C)。

注：本圖中，#1-#5為順鉑處理后第6天模型組大鼠腸道菌群，#6-#10為順鉑處理后第6天益生菌組大鼠腸道菌群。

圖6為順鉑處理后不同時(shí)期各組大鼠腸組織免疫熒光檢測(cè)結(jié)果。

注：腸組織嗜鉻粒蛋白A免疫熒光染色（左側(cè)），5-HT（中間），合并（右側(cè)）； con-3為順鉑處理后第3天空白組，cis-3為順鉑處理后第3天模型組，pro-3為順鉑處理后第3天益生菌組，con-6為順鉑處理后第6天空白組，cis-6為順鉑處理后第6天模型組，pro-6為順鉑處理后第6天益生菌組。

圖7為各組大鼠血清中5-HT的變化。

注：a表示與con-3比較p<0.05，b表示與con-6比較p<0.05 ,c表示與cis-3比較p<0.05,d表示與cis-6比較p<0.05；con-3為順鉑處理后第3天空白組，cis-3為順鉑處理后第3天模型組，pro-3為順鉑處理后第3天益生菌組，con-6為順鉑處理后第6天空白組，cis-6為順鉑處理后第6天模型組，pro-6為順鉑處理后第6天空白組。

圖8 各組大鼠結(jié)腸組織中5-HT變化。

注：a表示與con-3比較p<0.05，b表示與con-6比較p<0.05 ,c表示與cis-3比較p<0.05,d表示與cis-6比較p<0.05；con-3為順鉑處理后第3天空白組，cis-3為順鉑處理后第3天模型組，pro-3為順鉑處理后第3天益生菌組，con-6為順鉑處理后第6天空白組，cis-6為順鉑處理后第6天模型組，pro-6為順鉑處理后第6天空白組。

具體實(shí)施方式

下面將說(shuō)明本發(fā)明的具體實(shí)施方式：

一種復(fù)合益生菌制劑，由以下益生菌按照以下活菌數(shù)量比例混合而成：

短雙歧桿菌：嗜酸乳桿菌：干酪乳桿菌：嗜熱鏈球菌=1：1-3:1-3:1-3，且所述的復(fù)合益生菌制劑的總活菌數(shù)量為200-800億。

如上所述的復(fù)合益生菌制劑在制備降低5-羥色胺藥物中的應(yīng)用。

如上所述的復(fù)合益生菌制劑在制備改善腸黏膜炎藥物中的應(yīng)用。

實(shí)施例

SPF級(jí)SD雄性大鼠。隨機(jī)分為3組，每組14只，分別為空白組，順鉑+生理鹽水組(模型組：cis-0表示順鉑處理第0天，cis-3表示順鉑處理第3天，cis-6表示順鉑處理第6天)，順鉑+益生菌組 (益生菌組：pro-0表示順鉑處理第0天，pro-3表示順鉑處理第3天，pro-6表示順鉑處理第6天) 。益生菌組大鼠按本發(fā)明所公開的復(fù)合益生菌制劑的總菌數(shù)為1×10¹⁰CFU/只益生菌進(jìn)行灌胃，空白組和模型組以等體積生理鹽水進(jìn)行灌胃，灌胃時(shí)間總共為13天，灌胃后第6天，建立動(dòng)物模型，對(duì)模型組和益生菌組按6mg/kg順鉑劑量對(duì)大鼠進(jìn)行尾靜脈注射，空白組注射等體積生理鹽水，分別于注射后第3天每組處死一半數(shù)量的大鼠，剩下的于第6天處死。實(shí)驗(yàn)期間觀察：大鼠的進(jìn)食進(jìn)水量、高嶺土攝取量及死亡率、變性梯度凝膠電泳（DGGE）方法檢測(cè)腸道菌群多樣性、免疫熒光方法檢測(cè)腸嗜鉻細(xì)胞釋放5-HT情況、ELISA試劑盒檢測(cè)血清5-HT及結(jié)腸腸組織中5-HT的濃度。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下：

從大鼠平均高嶺土攝食量柱狀圖（圖1）可以看出，與空白組相比，順鉑建模后第1、2 、3天,模型組和益生菌組大鼠有明顯的攝食高嶺土行為，其中第1天最為嚴(yán)重，第2、3天攝食高嶺土行為有明顯減輕。與模型組相比，益生菌組大鼠對(duì)高嶺土攝食量減少明顯。

順鉑處理后各組大鼠腸道菌群多樣性的變化，從DGGE 電泳圖中（圖2)可以看出，模型組與順鉑處理前相比，順鉑注射后3天和6天，DGGE條帶數(shù)顯著降低（見表1），模型組0天，DGGE每個(gè)泳道平均有18.25±1.26個(gè)條帶，而順鉑處理后第3天，DGGE圖譜顯示平均有12.60±1.67個(gè)條帶。處理后6天，DGGE圖譜顯示平均有10.20±3.77個(gè)條帶，說(shuō)明順鉑處理，可使大鼠腸道菌群多樣性降低。由圖2可以看出，模型組6天，大鼠腸道菌群有明顯紊亂。

表1各組大鼠腸道菌群多樣性條帶分析（X ± S）

在益生菌組，與順鉑處理前相比，順鉑注射后3天到6天，DGGE條帶數(shù)降低不明顯（圖3），益生菌組0天，DGGE每個(gè)泳道平均有17.33±1.15個(gè)條帶，而順鉑處理后3天，DGGE圖譜顯示平均有15.00±1.41個(gè)條帶。處理后6天，DGGE圖譜顯示平均有15.20±1.64個(gè)條帶，說(shuō)明經(jīng)益生菌干預(yù)的，大鼠腸道菌群變化不明顯，結(jié)合圖4，圖5和表1可以看出，與模型組相比，順鉑處理后3天，益生菌組大鼠腸道菌群多樣性增加，順鉑處理后6天腸道菌群多樣性也無(wú)明顯紊亂。

利用Quantity One 軟件對(duì)大鼠腸道菌群DGGE圖譜進(jìn)行數(shù)字化處理，然后采用非加權(quán)成對(duì)算術(shù)平均算法（UPGMA）進(jìn)行各泳道條帶類型聚類分析。結(jié)果顯示：在模型組中，除模型組0天聚成單獨(dú)的一簇外，模型組3天和模型組6天有交叉，且組內(nèi)差異較大。說(shuō)明順鉑處理后，3天和6天腸道菌群紊亂。

在益生菌組中益生菌組6天和0天，未能明顯區(qū)分為兩大簇，說(shuō)明經(jīng)益生菌干預(yù)的大鼠，腸道菌群有明顯恢復(fù)。

順鉑處理后不同時(shí)期各組大鼠4種優(yōu)勢(shì)菌群的數(shù)量的變化：

從大鼠每克糞便中乳桿菌屬，雙歧桿菌屬，Clostridium cluster IV，Clostridium cluster XIV含量變化，表2可以看出：與模型組處理前相比，模型組處理后第3天和處理后第6天大鼠腸道菌群中乳桿菌屬，雙歧桿菌屬大幅度減少(p<0.05)，Clostridium cluster IV，Clostridium cluster XIV拷貝數(shù)增加顯著(p<0.05)；與模型組處理后第3天相比，模型組處理后第6天，乳桿菌屬，雙歧桿菌屬減少，Clostridium cluster IV增多，但Clostridium cluster XIV減少。

表2 腸道4種優(yōu)勢(shì)菌群的表達(dá)水平（拷貝數(shù)/每克糞便?？截悢?shù)/克糞便，x±s）

注： e表示與cis-0比較p<0.05，c表示與cis-3比較p<0.05,d表示與cis-6比較p<0.05 ,f表示與pro-0比較p<0.05,g表示與pro-3比較p<0.05；cis-0為順鉑處理后第0天模型組，cis-3為順鉑處理后第3天模型組，cis-6為順鉑處理后第6天模型組，pro-0為順鉑處理后第0天益生菌組，pro-3為順鉑處理后第3天空白組，pro-6為順鉑處理后第6天模型組。

與益生菌組處理前相比，益生菌組處理后第3天和處理后第6天大鼠腸道菌群中乳桿菌屬和雙歧桿菌屬均沒有顯著變化，Clostridium cluster IV數(shù)量增加，但與益生菌組處理前相比，Clostridium cluster XIV數(shù)量無(wú)明顯變化;與益生菌組處理后第3天相比，益生菌組處理后第6天大鼠腸道菌群中乳桿菌屬無(wú)明顯變化，雙歧桿菌屬拷貝數(shù)有減少趨勢(shì)，Clostridium cluster IV和Clostridium cluster XIV數(shù)量下降明顯(p<0.05)

與模型組處理后第3天和處理后第6天相比，益生菌組處理后第3天和處理后第6天，乳桿菌屬，雙歧桿菌屬大幅度增加(p<0.05)，而Clostridium cluster IV，Clostridium cluster XIV均大幅度減少(p<0.05)。

順鉑處理后不同時(shí)期各組大鼠腸組織免疫熒光檢測(cè)：

從免疫熒光結(jié)果（圖6）可以看出，在腸組織中模型組第3天，腸嗜鉻細(xì)胞釋放5-HT的量增加，而與模型組第3天相比，益生菌組第3天，釋放5-HT的腸嗜鉻細(xì)胞減少。順鉑處理后第6天，模型組中腸嗜鉻細(xì)胞釋放5-HT的量有所減少，而此時(shí)益生菌組與空白組相比沒有顯著差別。

順鉑處理后不同時(shí)期各組大鼠血清和結(jié)腸組織中5-HT的濃度變化：

與空白組比較，模型組第3天和第6天的血清中5-HT水平明顯升高（p<0.05)，且第6天與第3天IL-10水平變化不明顯（p<0.05）。與模型組比較，益生菌組第3天和第6天的結(jié)腸組織中5-HT水平有顯著降低（p<0.05）更接近于空白組水平。（圖7）

大鼠結(jié)腸組織中各組5-HT的含量見圖8。與空白組相比，模型組第3天和第6天的血清中5-HT水平明顯升高（p<0.05)，但第6天比第3天5-HT水平有所回降（p<0.05）。與模型組比較，益生菌組第3天和第6天的結(jié)腸組織中5-HT水平有顯著降低（p<0.05）更接近于空白組水平。