本申請涉及蛋白質(zhì)純化，具體涉及一種天然血紅蛋白a2的純化方法。
背景技術：
1、地中海貧血（簡稱“地貧”）是一組由于珠蛋白基因(地貧基因)缺陷使血紅蛋白中珠蛋白肽鏈合成障礙所致的遺傳性溶血性疾病。地中海貧血患者通常會出現(xiàn)貧血，因為身體無法制造足夠的血紅蛋白。血紅蛋白是一種幫助紅細胞攜帶氧氣的蛋白質(zhì)，如果沒有足夠的血紅蛋白，血液中的紅細胞就無法正常工作，無法有效地將氧氣輸送到全身的細胞，進而引起組織器官缺氧，從而使人感到疲倦。
2、成人的血紅蛋白（hb）通常由血紅蛋白a（hba，97％左右）和血紅蛋白a2（hba2，3％左右）組成。hba又可分為非糖化血紅蛋白，即天然血紅蛋白hba0，和糖化血紅蛋白hba1。血紅蛋白a2由2個α珠蛋白和2個δ珠蛋白組成，其升高是β地中海貧血患者的特征性指標，正常人群hba2水平在2.2%-3.3%范圍內(nèi)，典型的β地中海貧血基因攜帶者其hba2水平在4.0%-6.0%范圍。
3、傳統(tǒng)的hba2檢測方法常受樣本中雜蛋白，如hba1的干擾，準確性欠佳。在復雜的血液成分里，hba2與其他血紅蛋白(hba0、hba1)共存，分離純化難度高。以往的純化手段，諸如色譜柱分離、離子柱層析等，難以徹底去除結(jié)構(gòu)相近的干擾成分，致使后續(xù)定量分析誤差較大。而且，部分分離方法易造成目標蛋白變性失活，影響對其天然特性及功能的深入研究。此外，現(xiàn)有技術操作繁瑣、耗時久，不適用于臨床大量樣本快速處理需求。鑒于此，開發(fā)一種高效、能保留天然活性的hba2純化方法迫在眉睫。
技術實現(xiàn)思路
1、針對現(xiàn)有技術的不足，本申請?zhí)峁┝艘环N天然血紅蛋白a2的純化方法，先通過硼酸柱去除糖化血紅蛋白hba1，再通過抗體與血紅蛋白a中的β鏈的特異性結(jié)合，生成多聚體復合物，進而使得可以通過離心的方式將血紅蛋白a和血紅蛋白a2分離，進而制得純化的hba2凍干品。本申請?zhí)峁┑奶烊谎t蛋白a2的純化方法簡單高效，純化出的天然血紅蛋白a2純度高，可用于擴大生產(chǎn)，有廣闊的應用價值。
2、為達到上述目的，本申請采用包括如下步驟的技術方案：
3、紅細胞的破碎及提??；
4、過硼酸柱，得到富集hba0和hba2的混合液；
5、抗體與hba0的β鏈特異性結(jié)合，形成多聚體復合物；
6、離心分離多聚體復合物和hba2，得到純化的hba2；
7、制備hba2凍干品。
8、有益的技術效果：
9、通過硼酸柱上的硼酸基團，與糖化血紅蛋白hba1上的順式二醇基團形成共價復合物，從而使天然血紅蛋白中的糖化血紅蛋白hba1被硼酸柱靶向捕獲，達到分離hba1并富集hba0和hba2的效果，避免了hba1對后續(xù)hba2純化過程的干擾，顯著降低后續(xù)抗體處理以及進一步純化時的樣品復雜度。
10、而富集后的hba0和hba2的混合液可以經(jīng)過稍過量的血紅蛋白β多克隆抗體或血紅蛋白β單克隆抗體的處理，使得hba0與所述抗體特異性結(jié)合，形成分子量明顯大于hba2的多聚體復合物；同時所述抗體的分子量也高過hba2，從而可以通過離心的方式將多聚體復合物以及過量的抗體與hba2高效地分離。且該方法制得的hba2純度高，易于放大生產(chǎn)，適合hba2制劑的規(guī)?；苽?。
1.一種天然血紅蛋白a2的純化方法，其特征在于，包括如下步驟：
2.根據(jù)權利要求1所述的一種天然血紅蛋白a2的純化方法，其特征在于，所述紅細胞的破碎及提取的過程包括：
3.根據(jù)權利要求2所述的一種天然血紅蛋白a2的純化方法，其特征在于，所述全血與pbs緩沖液的質(zhì)量比為1:3；所述全血與純水的質(zhì)量比為1:3。
4.根據(jù)權利要求1所述的一種天然血紅蛋白a2的純化方法，其特征在于，所述過硼酸柱，得到富集hba0和hba2的混合液的過程包括：
5.?根據(jù)權利要求4所述的一種天然血紅蛋白a2的純化方法，其特征在于，所述含有50mm??；撬?naoh、20mm?mgcl2的平衡緩沖液ph值為8.5～8.9。
6.根據(jù)權利要求1所述的一種天然血紅蛋白a2的純化方法，其特征在于，所述抗體與hba0的β鏈特異性結(jié)合，形成多聚體復合物的過程包括：
7.根據(jù)權利要求6所述的一種天然血紅蛋白a2的純化方法，其特征在于，所述抗體包括血紅蛋白β多克隆抗體和血紅蛋白β單克隆抗體中的任意一種。
8.根據(jù)權利要求6所述的一種天然血紅蛋白a2的純化方法，其特征在于，所述抗體與富集hba0和hba2的混合液的質(zhì)量比為（1.2~1.5）：1。
9.根據(jù)權利要求1所述的一種天然血紅蛋白a2的純化方法，其特征在于，所述離心分離多聚體復合物和hba2，得到富集純化的hba2的過程包括：
10.根據(jù)權利要求1所述的一種天然血紅蛋白a2的純化方法，其特征在于，所述制備hba2凍干品的過程包括：