本發(fā)明涉及生物，特別是涉及一種表達人源cu/zn超氧化物歧化酶的工程菌株及其構(gòu)建方法和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
1、超氧化物歧化酶（superoxide?dismutase，sod）是一類重要的抗氧化酶，能夠催化超氧陰離子自由基（o2-）歧化為過氧化氫（h2o2）和氧氣（o2），從而保護細胞免受活性氧（reactive?oxygen?species，ros）的損傷。sod在生物體內(nèi)具有廣泛的分布，并且根據(jù)金屬輔因子的不同分為cu/zn超氧化物歧化酶、錳超氧化物歧化酶和鐵超氧化物歧化酶。其中，人源cu/zn超氧化物歧化酶因其高效、穩(wěn)定以及與人體相容性好等特點，在醫(yī)藥、化妝品等領(lǐng)域有著廣泛的應(yīng)用前景。
2、目前，工業(yè)上生產(chǎn)人源cu/zn超氧化物歧化酶的方法主要包括從動物組織中提取、基因工程菌表達等途徑。然而，這些方法存在以下問題：
3、提取法：由于人源cu/zn超氧化物歧化酶主要存在于紅細胞中，含量極低，導(dǎo)致提取成本高昂，產(chǎn)量有限，難以滿足市場需求。
4、大腸桿菌表達系統(tǒng)：雖然可以實現(xiàn)較高水平的表達，但大腸桿菌缺乏真核生物特有的翻譯后修飾機制，影響了蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)及生物學(xué)功能，使得產(chǎn)物的質(zhì)量和活性不穩(wěn)定。
5、哺乳動物細胞表達系統(tǒng)：盡管能夠進行正確的翻譯后修飾，但培養(yǎng)條件苛刻，周期長，成本高，不適合大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)。
6、本發(fā)明擬開發(fā)一種高效表達人源cu/zn超氧化物歧化酶的新方法——利用畢赤酵母（pichia?pastoris）作為宿主構(gòu)建工程菌，以實現(xiàn)人源cu/zn超氧化物歧化酶的高效表達和工業(yè)化生產(chǎn)。
技術(shù)實現(xiàn)思路
1、本發(fā)明的目的是提供一種表達人源cu/zn超氧化物歧化酶的工程菌株及其構(gòu)建方法和應(yīng)用，以解決上述現(xiàn)有技術(shù)存在的問題。該工程菌株能夠高效表達人源cu/zn超氧化物歧化酶，其表達量可達3g/l以上。
2、畢赤酵母作為一種甲醇營養(yǎng)型酵母，具備以下優(yōu)勢：具有強大的蛋白分泌能力，能夠?qū)⒅亟M蛋白高效地分泌到發(fā)酵液中，便于后續(xù)純化操作；具有完善的翻譯后修飾系統(tǒng)，能夠確保人源cu/zn超氧化物歧化酶獲得與天然狀態(tài)下相同的糖基化修飾，保證其結(jié)構(gòu)完整性和生物學(xué)活性；易于放大生產(chǎn)和降低成本，相較于哺乳動物細胞表達系統(tǒng)，畢赤酵母的生長速度快，培養(yǎng)基簡單廉價，適合大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)。因此，本發(fā)明利用畢赤酵母作為宿主構(gòu)建了能夠高效表達人源cu/zn超氧化物歧化酶的工程菌。
3、基于此，本發(fā)明提供了如下方案：
4、本發(fā)明提供一種表達人源cu/zn超氧化物歧化酶的工程菌株的構(gòu)建方法，包括以下步驟：
5、將人源cu/zn超氧化物歧化酶的編碼基因克隆到表達載體中，構(gòu)建得到重組質(zhì)粒；
6、將所述重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化畢赤酵母感受態(tài)細胞，構(gòu)建得到所述工程菌株；
7、所述編碼基因的核苷酸序列如seq?id?no.2所示。
8、進一步地，所述表達載體為ppiczαa載體。
9、進一步地，將所述編碼基因克隆到所述表達載體的ecor?i和not?i酶切位點之間。
10、進一步地，所述畢赤酵母感受態(tài)細胞為畢赤酵母gs115感受態(tài)細胞。
11、進一步地，采用電轉(zhuǎn)化方法將所述重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至所述畢赤酵母感受態(tài)細胞中。
12、本發(fā)明還提供一種根據(jù)上述的構(gòu)建方法構(gòu)建得到的表達人源cu/zn超氧化物歧化酶的工程菌株。
13、本發(fā)明還提供上述的表達人源cu/zn超氧化物歧化酶的工程菌株在發(fā)酵生產(chǎn)人源cu/zn超氧化物歧化酶中的應(yīng)用。
14、本發(fā)明還提供一種發(fā)酵生產(chǎn)人源cu/zn超氧化物歧化酶的方法，包括對上述的工程菌進行發(fā)酵培養(yǎng)，制備得到所述人源cu/zn超氧化物歧化酶的步驟。
15、進一步地，通過在發(fā)酵培養(yǎng)基中添加甲醇，實現(xiàn)對人源cu/zn超氧化物歧化酶的誘導(dǎo)表達。
16、進一步地，在所述發(fā)酵培養(yǎng)基中，所述甲醇的體積分數(shù)為1%。
17、本發(fā)明公開了以下技術(shù)效果：
18、本發(fā)明利用畢赤酵母作為宿主，構(gòu)建得到了一種能夠高效表達人源cu/zn超氧化物歧化酶的工程菌，其表達量可達3g/l以上，遠高于傳統(tǒng)方法的產(chǎn)量。
19、本發(fā)明采用畢赤酵母表達體系替代傳統(tǒng)的動物組織提取或哺乳動物細胞表達方式，大大降低了原材料采購、工藝流程控制等方面的費用支出，同時提高了產(chǎn)品的市場競爭力。
20、本發(fā)明為開發(fā)經(jīng)濟可行、環(huán)境友好且產(chǎn)品質(zhì)量優(yōu)良的人源cu/zn超氧化物歧化酶生產(chǎn)工藝提供了有力的技術(shù)支持，具有廣闊的應(yīng)用前景。
1.一種表達人源cu/zn超氧化物歧化酶的工程菌株的構(gòu)建方法，其特征在于，包括以下步驟：
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的構(gòu)建方法，其特征在于，所述表達載體為ppiczαa載體。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的構(gòu)建方法，其特征在于，將所述編碼基因克隆到所述表達載體的ecor?i和not?i酶切位點之間。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的構(gòu)建方法，其特征在于，所述畢赤酵母感受態(tài)細胞為畢赤酵母gs115感受態(tài)細胞。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的構(gòu)建方法，其特征在于，采用電轉(zhuǎn)化方法將所述重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至所述畢赤酵母感受態(tài)細胞中。
6.一種根據(jù)權(quán)利要求1-5任一項所述的構(gòu)建方法構(gòu)建得到的表達人源cu/zn超氧化物歧化酶的工程菌株。
7.一種如權(quán)利要求6所述的表達人源cu/zn超氧化物歧化酶的工程菌株在發(fā)酵生產(chǎn)人源cu/zn超氧化物歧化酶中的應(yīng)用。
8.一種發(fā)酵生產(chǎn)人源cu/zn超氧化物歧化酶的方法，其特征在于，包括對如權(quán)利要求6所述的工程菌進行發(fā)酵培養(yǎng)，制備得到所述人源cu/zn超氧化物歧化酶的步驟。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于，通過在發(fā)酵培養(yǎng)基中添加甲醇，實現(xiàn)對人源cu/zn超氧化物歧化酶的誘導(dǎo)表達。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其特征在于，在所述發(fā)酵培養(yǎng)基中，所述甲醇的體積分數(shù)為1%。