本發(fā)明屬于植物基因工程，具體涉及轉(zhuǎn)基因大豆中黃6106的特異性序列及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
1、雜草危害嚴(yán)重是影響大豆生產(chǎn)的主要難題，常規(guī)大豆雜草防治管理環(huán)節(jié)多、除草效果差；為提升除草效果常超量使用除草劑，不僅影響大豆正常生長(zhǎng)、降低產(chǎn)量，同時(shí)施用高殘留除草劑又影響輪作倒茬和種植結(jié)構(gòu)調(diào)整。培育耐除草劑轉(zhuǎn)基因大豆品種，配套使用高效低殘留的草甘膦等除草劑，可以有效解決除草難題，實(shí)現(xiàn)合理輪作和農(nóng)業(yè)綠色發(fā)展。
2、中黃6106是中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所利用土壤農(nóng)桿菌介導(dǎo)子葉節(jié)法，將耐草甘膦機(jī)理不同的g2-epsps和gat基因疊加轉(zhuǎn)化到大豆品種中黃10中，經(jīng)草甘膦篩選獲得的高耐草甘膦轉(zhuǎn)基因大豆轉(zhuǎn)化體。利用中黃6106培育和推廣耐草甘膦除草劑大豆新品種，對(duì)提高大豆生產(chǎn)中的田間雜草防治效率、降低生產(chǎn)成本，提高效益和農(nóng)民種豆積極性，增強(qiáng)國(guó)產(chǎn)大豆競(jìng)爭(zhēng)力等具有重要意義。
3、通過(guò)基因工程技術(shù)將外源基因轉(zhuǎn)入到植物基因組中插入位點(diǎn)具有一定的隨機(jī)性，但對(duì)于特定轉(zhuǎn)化體來(lái)說(shuō)外源基因片段插入大豆基因組中的位置具有唯一性，不會(huì)隨著雜交等品種選育的過(guò)程而改變，由此形成的插入片段及其旁側(cè)序列是轉(zhuǎn)化體的身份特征。傳統(tǒng)的方法通常采用tail-pcr或熱不對(duì)稱(chēng)pcr等，通過(guò)多次嵌套式擴(kuò)增逐步縮小目標(biāo)區(qū)域，最終得到插入位點(diǎn)兩側(cè)序列。高通量測(cè)序技術(shù)的發(fā)展使得通過(guò)全基因重測(cè)序方法快速鑒定插入位點(diǎn)更加簡(jiǎn)便高效。
4、在轉(zhuǎn)基因品種轉(zhuǎn)育和監(jiān)督管理過(guò)程中，需要對(duì)轉(zhuǎn)基因植株或其產(chǎn)品中是否含有特定的外源片段進(jìn)行判定，因此依據(jù)插入片段及其旁側(cè)序列建立轉(zhuǎn)基因大豆中黃6106和/或其相關(guān)材料的特異性檢測(cè)方法，對(duì)加快品種轉(zhuǎn)育和有效監(jiān)管具有重要意義。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
1、本發(fā)明的目的之一在于提供轉(zhuǎn)基因大豆中黃6106的特異性序列及其應(yīng)用，所述特異性序列包括外源插入片段全序列及其旁側(cè)序列。
2、本發(fā)明的目的之二是建立了轉(zhuǎn)基因大豆中黃6106的特異性pcr檢測(cè)方法及試劑盒，可特異性檢測(cè)待測(cè)樣品中是否含有轉(zhuǎn)基因大豆中黃6106的成分，檢測(cè)方法快速簡(jiǎn)便，準(zhǔn)確可靠。
3、本發(fā)明提供了轉(zhuǎn)基因大豆中黃6106的特異性序列，包括外源插入片段全序列與旁側(cè)序列，所述特異性序列的核苷酸序列如seq?id?no.1所示。
4、作為一種優(yōu)選方案，所述特異性序列位于大豆參考基因組(glycinemaxwm82.a2.v1)的17號(hào)染色體上。
5、本發(fā)明還提供了用于檢測(cè)轉(zhuǎn)基因大豆中黃6106的dna序列，其包含至少部分權(quán)利要求1所述的外源插入片段全序列和旁側(cè)序列，且旁側(cè)序列部分與外源插入片段部分順序相連。
6、本發(fā)明還提供了特異性擴(kuò)增本發(fā)明所述特異性序列或本發(fā)明所述dna序列的特異性引物對(duì)，包括以下至少一對(duì)：特異性引物對(duì)1、特異性引物對(duì)2、特異性引物對(duì)3和特異性引物對(duì)4；
7、所述特異性引物對(duì)1的正向引物如seq?id?no.2所示，所述特異性引物對(duì)1的反向引物如seq?id?no.3所示；
8、所述特異性引物對(duì)2的正向引物如seq?id?no.4所示，所述特異性引物對(duì)2的反向引物如seq?id?no.5所示；
9、所述特異性引物對(duì)3的正向引物如seq?id?no.6所示，所述特異性引物對(duì)3的反向引物如seq?id?no.7所示；
10、所述特異性引物對(duì)4的正向引物如seq?id?no.8所示，所述特異性引物對(duì)4的反向引物如seq?id?no.9所示。
11、本發(fā)明還提供了一種檢測(cè)本發(fā)明所述特異性序列或本發(fā)明所述dna序列的試劑盒，所述試劑盒包含本發(fā)明所述的特異性引物對(duì)。
12、本發(fā)明還提供了本發(fā)明所述的特異性序列或本發(fā)明所述的dna序列或本發(fā)明所述的特異性引物對(duì)或本發(fā)明所述的試劑盒的應(yīng)用，所述應(yīng)用包括以下至少一種：
13、特異性檢測(cè)轉(zhuǎn)基因大豆中黃6106和/或轉(zhuǎn)基因大豆中黃6106相關(guān)材料；所述轉(zhuǎn)基因大豆中黃6106相關(guān)材料包括親本和/或后代；檢測(cè)對(duì)象包括植株、組織、種子及大豆制品的一種或多種；
14、耐草甘膦大豆的輔助育種；
15、制備耐草甘膦大豆輔助育種的產(chǎn)品；
16、鑒定或輔助鑒定大豆耐草甘膦特性；
17、制備鑒定或輔助鑒定大豆耐草甘膦的產(chǎn)品；
18、選育或輔助選育耐草甘膦大豆；
19、制備選育或輔助選育耐草甘膦大豆的產(chǎn)品。
20、本發(fā)明還提供了一種特異性檢測(cè)轉(zhuǎn)基因大豆中黃6106和/或轉(zhuǎn)基因大豆中黃6106相關(guān)材料的方法，包括以下步驟：
21、以待測(cè)樣品dna為模板，利用本發(fā)明所述的特異性引物對(duì)進(jìn)行pcr擴(kuò)增，得到擴(kuò)增片段，根據(jù)擴(kuò)增片段判斷待測(cè)樣品中是否含有轉(zhuǎn)基因大豆中黃6106的成分。
22、作為一種優(yōu)選方案，所述pcr擴(kuò)增的體系以25.0μl計(jì)為：10×pcr緩沖液2.5μl，dntps混合溶液2.0μl，10μmol/l正向引物1.0μl，10μmol/l反向引物1.0μl，taq?dna聚合酶0.5μl，25mg/l?dna模板2.0μl，ddh2o補(bǔ)足至25.0μl。
23、作為一種優(yōu)選方案，所述pcr擴(kuò)增的程序?yàn)椋?4℃變性5min；94℃變性30s，58℃退火30s，72℃延伸30s，共進(jìn)行40次循環(huán)；72℃延伸5min。
24、本發(fā)明還提供了利用本發(fā)明所述的特異性檢測(cè)大豆轉(zhuǎn)基因大豆中黃6106和/或轉(zhuǎn)基因大豆中黃6106相關(guān)材料的方法得到的擴(kuò)增片段。
25、本發(fā)明還提供了本發(fā)明所述的擴(kuò)增片段的應(yīng)用，所述應(yīng)用包括以下至少一種：
26、特異性檢測(cè)轉(zhuǎn)基因大豆中黃6106和/或轉(zhuǎn)基因大豆中黃6106相關(guān)材料；所述轉(zhuǎn)基因大豆中黃6106相關(guān)材料包括親本和/或后代；檢測(cè)對(duì)象包括植株、組織、種子及大豆制品的一種或多種；
27、耐草甘膦大豆的輔助育種；
28、制備耐草甘膦大豆輔助育種的產(chǎn)品；
29、制備鑒定或輔助鑒定大豆耐草甘膦的產(chǎn)品；
30、制備選育或輔助選育耐草甘膦大豆的產(chǎn)品。
31、有益效果：本發(fā)明提供了大豆中黃6106的特異性序列，包括外源插入片段全序列與旁側(cè)序列，所述特異性序列的核苷酸序列如seq?id?no.1所示。本發(fā)明通過(guò)大豆中黃6106的特異性序列設(shè)計(jì)的引物可有效檢測(cè)待測(cè)樣品中是否含有轉(zhuǎn)基因大豆中黃6106的成分，檢測(cè)方法快速簡(jiǎn)便，準(zhǔn)確可靠。
32、本發(fā)明的檢測(cè)方法為pcr法，相較于其他方法，操作相對(duì)簡(jiǎn)便，不需要復(fù)雜的處理步驟，同時(shí)本發(fā)明的方法成本低，不需要昂貴的儀器和試劑。這使得本發(fā)明特異性檢測(cè)轉(zhuǎn)基因大豆中黃6106和/或轉(zhuǎn)基因大豆中黃6106相關(guān)材料的方法易于在各級(jí)實(shí)驗(yàn)室推廣和應(yīng)用。
1.轉(zhuǎn)基因大豆中黃6106的特異性序列，其特征在于，所述特異性序列包括外源插入片段全序列及其旁側(cè)序列，所述特異性序列的核苷酸序列如seq?id?no.1所示。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的特異性序列，其特征在于，所述特異性序列位于大豆參考基因組的17號(hào)染色體上。
3.用于檢測(cè)轉(zhuǎn)基因大豆中黃6106的dna序列，其特征在于，其包含至少部分權(quán)利要求1所述的外源插入片段全序列和旁側(cè)序列，且旁側(cè)序列部分與外源插入片段部分順序相連。
4.特異性擴(kuò)增權(quán)利要求1或2所述特異性序列或權(quán)利要求3所述dna序列的特異性引物對(duì)，其特征在于，包括以下至少一對(duì)：特異性引物對(duì)1、特異性引物對(duì)2、特異性引物對(duì)3和特異性引物對(duì)4；
5.一種檢測(cè)權(quán)利要求1或2所述特異性序列或權(quán)利要求3所述dna序列的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包含權(quán)利要求4所述的特異性引物對(duì)。
6.權(quán)利要求1或2所述的特異性序列或權(quán)利要求3所述的dna序列或權(quán)利要求4所述的特異性引物對(duì)或權(quán)利要求5所述的試劑盒的應(yīng)用，其特征在于，所述應(yīng)用包括以下至少一種：
7.一種特異性檢測(cè)轉(zhuǎn)基因大豆中黃6106和/或轉(zhuǎn)基因大豆中黃6106相關(guān)材料的方法，其特征在于，包括以下步驟：
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，所述pcr擴(kuò)增的體系以25.0μl計(jì)為：10×pcr緩沖液2.5μl，dntps混合溶液2.0μl，10μmol/l正向引物1.0μl，10μmol/l反向引物1.0μl，taq?dna聚合酶0.5μl，25mg/ldna模板2.0μl，ddh2o補(bǔ)足至25.0μl；
9.利用權(quán)利要求7或8所述的方法得到的擴(kuò)增片段。
10.權(quán)利要求9所述的擴(kuò)增片段的應(yīng)用，其特征在于，所述應(yīng)用包括以下至少一種：